食管鳞状细胞癌组织中BTG-1的表达及其对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响

[摘要] 目的 分析食管鱗状细胞癌组织中B细胞转位基因1（BTG-1）的表达及其对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响。 方法 选取郑州大学第一附属医院2014年1月～2017年12月存档的164个鳞状细胞癌存档手术或内镜活检蜡块、76个癌旁正常组织手术蜡块作为研究对象，采用免疫组化法、原位杂交检测BTG1蛋白表达并分析其与病理参数的关系;建立BTG-1过量表达细胞株，AnncxinV-FITC/PI双标记流式细胞仪检测人食管鳞状细胞癌细胞株EC9706的凋亡情况。 结果 食管鳞状细胞癌组织BTG-1蛋白、信使核糖核酸（mRNA）阳性表达率低于癌旁正常组织（χ2=32.718、55.729，均P < 0.001）;且有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级Ⅱ～Ⅲ级标本中BTG-1蛋白、mRNA阳性表达率显著较低（χ2=29.078、5.970、7.660、31.127、8.624、10.624，均P < 0.001）;且BTG-1组早期细胞凋亡率显著高于空白对照组（t = 15.484，P < 0.001）。 结论 食管鳞状细胞癌组织中BTG1的表达显著低于癌旁正常组织，且其与有无淋巴结转移、TNM分期、组织学分级的关系密切，BTG-1高表达或可促进食管鳞状细胞癌细胞凋亡。

[关键词] 鳞状细胞癌;B细胞转位基因1;食管鳞状细胞癌细胞株EC9706;凋亡

[中图分类号] R735.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（a）-0007-04

[Abstract] Objective To analyze the expression of B-cell translocation gene 1 （BTG-1） in tissue of esophageal squamous cell carcinoma and the effect on apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706. Methods A total of 164 paraffin blocks of squamous cell carcinoma collected through surgery or endoscopic biopsy and 76 adjacent normal tissue surgical blocks were collected from the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from January 2014 to December 2017. The expression of BTG-1 protein and mRNA in the two groups were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization， and their relationships with pathological parameters were analyzed. The BTG-1 overexpressing cell line was established， and the apoptosis of human esophageal squamous cell carcinoma cell line EC9706 was detected by AnnexinV-FITC/PI double labeling flow cytometry. Results The positive expression rates of BTG-1 protein and messenger ribonucleic acid （mRNA） in esophageal squamous cell carcinoma tissues were significantly lower than those in adjacent normal tissues （χ2=32.718， 55.729; all P﹤ 0.001）. The positive expression rates of BTG-1 protein and mRNA in specimens with lymph node metastasis， at TNM stage Ⅲ - Ⅳ and histological grade Ⅱ - Ⅲ were significantly lower than those without lymph node metastasis， at TNM stage Ⅰ - Ⅱ and of histological grade Ⅰ （χ2=29.078， 5.970， 7.660， 31.127， 8.624， 10.624; all P﹤0.001）. The early apoptosis rate in BTG-1 group was significantly higher than that in blank control group （t = 15.484， P < 0.001）. Conclusion The expression of BTG1 in tissues of esophageal squamous cell carcinoma is significantly lower than that in adjacent normal tissues. It is closely related to the presence of lymph node metastasis， TNM stage and histological grade. High expression of BTG-1 may promote the apoptosis of cell of esophageal squamous cell carcinoma.

[Key words] Esophageal carcinoma; B-cell translocation gene 1; Esophageal squamous carcinoma cell line EC9706; Apoptosis

食管癌具高浸润、转移特征，根据其组织学分型，主要有鳞状细胞癌、腺癌、未分化癌等，其中以鳞状细胞癌比例最高;因食管癌初期临床症状不具特异性，多数患者就诊时病情已进展至中晚期。当前针对食管癌的治疗方式虽然较多，如放化疗、生物治疗、介入治疗等，但仍未取得满意效果，中晚期患者5年生存率仍仅为10%左右，其预后极差[1-4]。B细胞转位基因1（B-cell translocation gene 1，BTG-1）是新发现的抑癌症基因，属BTG/Tob抗增殖基因家族一员，研究[5]指出，BTG-1在促进细胞凋亡、弱化肿瘤细胞侵袭转移能力中发挥重要作用。近年来，BTG-1与前列腺癌、甲状腺癌、妇科肿瘤等临床病理参数的相关性及其在对应肿瘤疾病中的表达情况均获得广泛探讨，但食管癌组织中BTG1的表达类研究相对少见[6-8]。鉴于此，现采集食管鳞状细胞癌细胞标本研究探讨，具体报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月～2017年12月郑州大学第一附属医院（以下简称“我院”）收治的食管癌患者，共计164例，均为鳞状细胞癌存档手术或内镜活检取样蜡块，其中76例存档癌旁正常组织手术蜡块。其中男96例，女68例;年龄37～75岁，平均（52.37±8.12）岁;组织学分型Ⅰ期104例，Ⅱ期34例，Ⅲ期26例;淋巴结转移102例，无淋巴结转移62例;TNM分期Ⅰ期60例，Ⅱ期48例，Ⅲ期39例，Ⅳ期17例;所存档蜡块患者均未经任意放化疗或生物治疗等积极治疗。鳞状细胞癌组织标本、癌旁正常组织标本获取均经由患者知情同意，并获得医院医学伦理委员会审核通批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试药  免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;原位杂交预交液、SA-Bio-AP、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司;原位杂交5′端生物标记素、全硫代修饰探针均购自北京奥科生物技术有限责任公司;光学显微镜购自日本OLYMPUS技术公司;离心机购自北京离心机厂;苏木素染色液购自天津化学试剂厂;BTG-1基因序列为：GCGATGGCTCTAGTCCAGATGC，获取自NCBI网站，原位杂交5′端生物素标记、探针均购自北京奥科生物技术有限责任公司。

1.2.2 食管鳞状细胞癌组织中BTG-1表达  ①免疫组化法（SP）：存档石蜡切片常规脱蜡、水化，抗原高压修复后3%过氧化氢10 min阻断内源性过氧化物酶，10%山羊血清室温封闭20 min，BTG-1抗体（1∶200）湿盒4℃过夜，滴加二抗，室温湿盒内孵育20 min，滴加三抗，室温湿盒内孵育20 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素染色液复染后分化、返蓝，再常规脱水、透明、封片，常温存档2～3 d后显微镜下读片;5个视野/切片，3张切片/标本，以磷酸缓冲盐溶液（PBS）为阴性对照。②原位杂交：切片重复脱蜡2次，10 min/次，梯度乙醇预处理5 min后置于焦碳酸二乙酯（DEPC）水中，0.5%过氧化氢室温下灭活，暴露mRNA核酸片段，1%多聚甲醛/0.1 mol PBS（pH值7.2～7.6），1/1000 DEPC室温固定;预杂交处理后滴加含标记探针的杂交液，剂量1 ng/L，盖膜并在42℃条件下杂交12 h后柠檬酸钠缓冲液（SSC，0.1×）洗脱非特异性杂交（15 min，42℃，4次），碱性磷酸酶底物（BCIP/NBT）显色，显色满意后脱水、封固，室温存放2～3 d后显微镜下读片，以不含探针的标本为阴性对照组。③食管癌组织中BTG-1mRNA、蛋白阳性表达评分标准：阳性细胞百分比<5%记0分、5～25%记1分、>25%～50%记2分、>50%记3分;细胞无染色记0分、细胞染色呈浅黄色记1分、黄褐色记2分、棕黄色记3分，阳性细胞百分比与细胞染色程度记分之和≤3分为阴性，>3分為阳性。

1.2.3 BTG-1对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响  人食管鳞状细胞癌细胞株培养至细胞密度70%～80%后分别加入1 mL含BTG-1基因的pLenti6-BTG1质粒的病毒液、含pLenti6/V5-DEST对照质粒病毒液继续培养4 h后更换培养基，滴加5 μg/mL Blastidicin，10 d后筛选克隆接种于24孔培养板，细胞长满后继续扩大培养，筛选pLenti6/H1299细胞稳定转染株为空白对照组、pLenti6-BTG1/H1299细胞稳定转染株作为BTG-1组;参照AnncxinV-FITC/PI试剂盒操作说明书，将空白对照组、BTG-1组细胞接种于96孔培养板，每组设6孔，0.2%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞培养液并置于离心管，1000 r/min离心5 min，离心半径13.5 cm，弃上清，细胞计数板对细胞进行计数，选取1×105～5×105个/mL重悬细胞，100 r/min离心5 min，离心半径13.5 cm，弃上清液，500 μL结合液重悬，依次滴加5 μL AnncxinV-FITC、5 μL碘化丙啶，充分混匀后避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡，激发光波波长488 nm、发射光波波长530 nm，AnncxinV-FITC、PI分别为红、绿色荧光，单个样本检测10 000个细胞，30 min内完成，以AnncxinV-FITC、PI单染OE-33细胞作为参照，CellQuest软件计算细胞凋亡比，细胞凋亡情况坏死区（AnncxinV-FIT-、PI+，位于左上区）、晚期细胞凋亡区（AnncxinV-FIT+、PI+，位于右上区）、活细胞区（AnncxinV-FIT -、PI-，位于左下区）、早期细胞凋亡区（AnncxinV-FIT +、PI-，位于右下区）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 食管鱗状细胞癌组织中BTG-1蛋白表达情况

食管鳞状细胞癌组织中BTG-1蛋白阳性表达率显著低于癌旁正常组织，差异有高度统计学意义（χ2 = 32.718，P < 0.001）。见表1、图1（封四）。

2.2 食管鳞状细胞癌组织中BTG-1mRNA表达

食管鳞状细胞癌组织中BTG-1mRNA阳性表达率显著低于癌旁正常组织，差异有高度统计学意义（χ2=55.729，P < 0.001）。见表2、图2（封四）。

2.3 不同病理特征的食管鳞状细胞癌组织中BTG-1表达比较

鳞状细胞癌组织中BTG-1蛋白、BTG-1 mRNA阳性表达在性别、年龄、组织学病理分型等方面差异无统计学意义（P > 0.05）;但有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级Ⅱ～Ⅲ级鳞状细胞癌组织标本中BTG-1蛋白、BTG-1 mRNA阳性表达率显著较低（均P < 0.05）。见表3。

2.4 BTG-1对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响

BTG-1组早期细胞凋亡率[（10.46±0.87）%]显著高于空白对照组[（2.27±0.96）%]，差异有高度统计学意义（t = 15.484，P < 0.001）。见图3～4。

3 讨论

食管鳞状细胞癌作为预后较差的恶性肿瘤，其发生、发展虽与肿瘤细胞过度增殖、分化能力降低有密切关系[9-12]，但肿瘤细胞的持续生长仅靠增殖抑制只能取得延缓获益，如何诱导肿瘤细胞凋亡才是肿瘤细胞缩小、消失的根本途径[13-16]。然而，细胞凋亡既可发生于生理条件、亦可发生于病理条件。一般来说，细胞死亡过程具自发性、程序化特征，而这一过程又受多种因素影响，并涉及与其相关的多个基因变化，通过对肿瘤细胞诱导促进其凋亡对食管鳞状细胞癌的临床诊治有重要意义[17-18]。BTG-1是定位于第8～12号染色体的BTG/Tob抗增殖基因家族成员之一，分子质量1.9×104，含5620个碱基对，可编码171个氨基酸，作为抗增殖基因家族中的一员，其减缓细胞增殖的作用已相对明确[19-20]。随着研究深入，BTG-1在机体病理、生理发展过程中所发挥的重要作用被广泛重视。有报道[21]指出，BTG-1高表达可通过对促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白间的平衡调控作用促进细胞凋亡。

本研究亦显示，食管鳞状细胞癌组织标本中BTG-1蛋白、mRNA阳性表达率显著低于癌旁正常组织，且有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级Ⅱ～Ⅲ级标本中BTG-1蛋白、mRNA阳性表达率分别显著低于无淋巴结转移迹象、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、组织学分级Ⅰ级标本（P < 0.05），这与冯盼盼等[22]的报道结论相似，其研究对象为胃腺癌组织，较正常癌旁组织黏膜组织，胃腺癌组织中BTG-1蛋白、mRNA明显低表达，并与肿瘤细胞TNM分期、淋巴结转移显著相关，提示肿瘤组织中BTG-1蛋白表达量与肿瘤疾病发展密切相关;且经AnncxinV-FITC/PI双标记流式细胞仪检测，BTG-1组早期细胞凋亡率显著高于空白对照组，提示BTG-1高表达或可促进肿瘤细胞凋亡;这与孙国贵等[23]报道结论相符，其报道BTG-1转染可促进肺癌细胞早期凋亡;但当前针对BTG-1对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706细胞凋亡的相关研究十分鲜见，且细胞凋亡过程极为精密、复杂，并涉及多种基因、调控因子，如癌症基因、抑癌基因、各种调控基因等，从基因表达、信号传导等途径探究BTG-1对食管鳞状细胞癌细胞凋亡的影响仍有极大的探究空间。

综上所述，食管鳞状细胞癌组织存在BTG-1低表达现象，BTG转染对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡有明显促进作用，或可为食管鳞状细胞癌临床治疗提供新方向。

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（收稿日期：2018-05-22  本文编辑：王   蕾）