肉桂酸锗对小鼠S180肉瘤的影响

摘 要：目的：探讨肉桂酸锗对荷S180肉瘤小鼠凋亡相关蛋白Caspase-3的合成及核仁组成区嗜银蛋白（AgNOR）合成的影响。方法：建立荷S180肉瘤小鼠模型，肉桂酸锗口服灌胃给药后，应用Western blotting法定量检测凋亡相关蛋白Caspase-3的合成情况以及油镜下观察S180肉瘤细胞中AgNOR颗粒增值情况。结果：肉桂酸锗用药组S180细胞中Caspase-3蛋白含量及AgNOR颗粒数，均与空白对照组有显著性差异（P<0.01）。结论：肉桂酸锗能显著促进Caspase-3的合成，诱导其细胞凋亡，并能抑制S180细胞中AgNOR的合成，抑制肿瘤细胞增值，肉桂酸锗具有明显的抗肿瘤作用。

关键词：肉桂酸锗 S180 Caspase-3 核仁组成区嗜银蛋白

Caspase-3 （分子量为 32kDa）是执行凋亡的主要酶，存在于细胞浆和细胞核，负责大概所有关键蛋白的切割。Caspase-3 在组织中广泛分布，在淋巴细胞发育中高度表达，为多数细胞凋亡途径中的末端关键效应蛋白酶，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，其表达意味着细胞死亡[1] 。核仁组成相关嗜银蛋白（Nucleolar organizer region assoiated argyrophil protein， AgNOR）位于细胞核核仁中的DNA环上，因为含有rRNA基因而与核仁形成有关，因而籍AgNOR染色技术对肿瘤研究有重要意义。在肿瘤的发生发展过程中，良性肿瘤与恶性肿瘤的细胞核及核仁结构和功能都会出现不同的变化，这种变化有助于区分良、恶性肿瘤及判断恶性肿瘤预后。本实验通过体内实验应用Western blotting和AgNOR染色技术分别检测各实验组S180肉瘤细胞中的Caspase-3和 AgNOR的表达，研究比较各实验组肿瘤细胞的增殖与凋亡现象，从病理学和细胞分子生物学的角度探讨肉桂酸锗的抗肿瘤作用机制。

1 实验材料和方法

1.1材料

1.1.1 动物 近交系昆明种清洁级小鼠50只，雄性，18-22g，一级屏障环境饲养、温度20-24℃、相对湿度40﹪-60﹪的环境下完成动物实验，小鼠由江西中医学院动物实验中心提供。

1.1.2 瘤细胞 小鼠S180肉瘤细胞株，购自浙江省医学科学院肿瘤研究所，本实验室常规传代保存。

1.1.3 主要药物及试剂 肉桂酸锗（由江西中医学院化学实验室黄桂林教授合成），注射用环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体为美国Sigma 公司产品（购自北京中山金桥生物技术公司） 。

1.2 实验方法

1.2.1 建立荷瘤鼠模型及分组 选取传代接种后7-10d、肿瘤生长良好、腹部隆起明显的瘤源小鼠，断椎处死，于超净工作台无菌条件下从腹腔抽出瘤液，用灭菌生理盐水调整瘤细胞数至4.0X107/ml，每鼠右腋皮下接种0.2ml。将接种了S180肉瘤的小鼠随机分为空白对照组（0.9﹪生理盐水）、阳性对照组（环磷酰胺组2.5mg/ml）、和肉桂酸锗处理组高剂量组（400µg/ml）、中剂量组（200µg/ml）、低剂量组（100µg/ml），每组10只。接种次日同时灌胃给药，给药量均为0.2ml/20g，每日给药一次，连续10日。停药次日断椎处死剥离瘤块。

1.2.2 Caspase-3测定瘤细胞凋亡情况

按照蛋白提取试剂盒操作说明提取瘤组织蛋白，测定蛋白含量。分别取各组蛋白依次电泳， 转膜， 脱脂牛奶封闭，加一抗兔抗鼠Caspase-3（内参照β- actin 抗体） 在4℃下孵育过夜， 漂洗， 再用二抗（ 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG）37℃ 震荡孵育2h， 洗涤，DAB显色3-5分钟， 扫描各蛋白条带的含量。

1.2.3核仁组成区蛋白染色镜检瘤细胞增值情况

常规石蜡切片脱蜡水化后，应用核仁组成区蛋白染色法染肿瘤细胞核仁组成区蛋白，每张切片任选3个视野，计算肿瘤细胞核仁组成区蛋白颗粒数。

2 结果

2.1肉桂酸锗对小鼠S180肉瘤细胞Caspase-3表达的影响

表1 各组肿瘤Caspase-3蛋白印记平均灰度值

组别剂量（µg/20g）动物数（只） 灰度值比

生理盐水组103.61±0.23

环磷酰胺组500107.92±1.76 **

低剂量组10109.12±0.40 **

中剂量组20109.94±0.63 **

高剂量组40105.30±1.13 **

与生理盐水组比较，** P<0.01

β-actin caspase-3

2.2 AgNOR结果评价

①颗粒计数:油镜下（ ×100）随机计数100个细胞核内所能分辨的黑色小颗粒（AgNOR）的总数，换算为每个细胞核内AgNOR平均数。②颗粒形态观察:圆形小颗粒为规则，块状、条索状及不规则形为不规则[2]。

表2 每组肿瘤细胞AgNOR颗粒数目和形态

组别剂量（µg/20g）动物数（只） 颗粒数规则％不规则％

生理盐水组106.72±0.8738.2261.78

环磷酰胺组500104.53±1.04** 65.2734.73

低剂量组10105.12±2.04*61.4338.57

中剂量组20104.98±1.66**68.7631.24

高剂量组40105.46±2.16*63.2136.79

与生理盐水组比较，* P<0.05，** P<0.01

3 讨论

近年，国内外许多学者研究发现了多种具有抗癌活性的有机锗化合物。肉桂酸锗是一种新型的有机锗化合物，实验研究表明其对小鼠U14宫颈癌肿瘤具有明显的抑制作用[3]。本实验研究发现肉桂酸锗能促进S180肉瘤细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3的激活，并抑制其核仁组成区蛋白的合成，从而起到抑制肿瘤生长的作用。

Caspase-3为Caspases 家族成员中研究最多、功能相对较明确的蛋白酶， 它广泛分布于各种类型的细胞中， 在细胞内以无活性的前体（ 酶原） 形式存在， 被激活后在细胞凋亡中发挥关键作用， 为凋亡效应分子， 是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶[4]。肿瘤细胞调亡时常伴有caspase-3的激活，Caspase-3在肿瘤中的表达不仅存在组织特异性．在不同肿瘤组织演进过程中所起的作用也不相同。在多种细胞的凋亡过程中均有Caspase-3的活性的变化[5]。本实验通过Westernblottling检测发现，肉桂酸锗能明显诱导Caspase-3基因的激活，从而诱导S180肉瘤细胞的凋亡，抑制其生长及浸润。AgNOR的主要功能是转录rRNA合成蛋白质，这说明AgNOR与rRNA基因的活性有关，蒋文晖等[6]在对口腔粘膜恶性肿瘤的研究中发现，随着肿瘤恶性程度的增高，口腔黏膜上皮细胞中AgNOR 计数值呈递增趋势，与病变的生物学行为平行。本实验通过AgNOR染色发现，肉桂酸锗能明显抑制S180肉瘤细胞核仁组成区蛋白的合成，从而抑制肿瘤rRNA的合成，起到抗肿瘤的作用。

参考文献:

[1]Cohen GM. Caspases : the executioners of apoptosis.Biochem J， 1997 ， 326 : 1-16.

[2] 肖 颖，盛传家.AgNOR检测在卵巢良、恶性肿瘤鉴别诊断中的价值[J]. 河北医学，2006，12（3）:204-205.

[3]黄桂林，陈晓东，肖纯，等.肉桂酸锗对小鼠宫颈癌14号抑制作用的研究[J].药物研究，2002，11（4）：42.

[4]尹伶，濮德敏，韦立蓓，等.Caspase3在NS- 398诱导宫颈癌Hela细胞

凋亡中的作用[J] 中国肿瘤临床，2007，34（12）：711.

[5]刘希双，侯仁好，初晓艺. Bcl-2与Caspase-3蛋白在胃癌中的表达及其意义[J]青岛大学医学院学报，2005，41（3）:232-234.

[6]蒋文晖，黄晓峰. AgNOR 技术的“一法多用” [J].临床与实验病理学杂志，2004，20（1）：110-111。

作者简介：

林波，男，山东聊城人，医学硕士，毕业于山东大学护理学院，淮阴卫生高等职业技术学校成人护理第一教研室教师