丝裂霉素—C抑制大鼠代膀胱分泌黏液的实验研究

【摘要】 目的：利用大鼠代膀胱模型，观察丝裂霉素-C和无水乙醇对肠黏膜和杯状细胞的作用。方法：实验用SD大鼠20只按照随机数字表法分为生理盐水对照（NS）组、丝裂霉素（MMC）组（0.6 mg/ml）。建立大鼠代膀胱模型，分别于模型建立后的第8、11、14天灌注丝裂霉素-C，留取尿液标本，第17天处死大鼠，取代膀胱组织，行HE染色、AB-PAS染色以及MUC-2免疫组化染色，测定尿液中的总黏液蛋白以及唾液酸的浓度，对肠黏膜进行黏膜评分。结果：MMC组黏蛋白浓度（4.16±0.97）mg/ml较NS组（11.63±2.31）mg/ml显著降低（P<0.05）；MMC组唾液酸浓度（199.7±26.6）mg/L较NS组（411.4±45.1） mg/L显著降低（P<0.05）；AB-PAS：MMC组的蓝染杯状细胞比例（15.73±4.1）0%与NS组（42.96±9.51）%相比差异有统计学意义（P<0.05）。Muc-2免疫组化：MMC组杯状细胞数（39.12±5.98）与NS组（35.22±7.20）相比无显著性差异，回肠黏膜评分：MMC组（平均秩24.88）与NS组（平均秩10）相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论：丝裂霉素-C可使尿液中黏蛋白浓度以及唾液酸浓度显著下降，同时丝裂霉素可使成熟杯状细胞比例下降。

【关键词】 丝裂霉素-C； 代膀胱； Muc-2； 杯状细胞

中图分类号 R737.14 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2015）33-0155-03

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2015.33.075

尿流改道手术是泌尿外科治疗浸润性膀胱肿瘤的一种有效治疗方式[1]。膀胱全切后的尿路重建术式主要有三类：不可控尿流改道、可控式尿流改道、膀胱重建。然而不管采用何种术式，术后肠道与泌尿道均保留了其自身的神经和血管，因此肠黏液的分泌功能依然存在[2]。鉴于尿流改道术后远期随着时间推移，肠绒毛和微绒毛会逐渐萎缩，黏液分泌量也随之会减少，故如何能以持久、有效的方法来抑制或减少术后早期肠黏液的分泌和排放是一直以来国内外学者致力研究的课题[3]。本实验利用大鼠代膀胱模型，观察丝裂霉素对肠黏膜上皮分泌以及形态结构的影响情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

由大连医科大学实验动物中心提供的健康SD大鼠20只，体重250～270 g，许可证号SCXK（辽）2008-0002。按照随机数字表法分为2组：生理盐水对照组（NS组，n=10）、丝裂霉素组（MMC组，0.6 mg/ml，n=10）。

1.2 主要试剂

大鼠MUC-2多克隆抗体（兔抗鼠）；BCA蛋白浓度测定试剂盒；唾液酸浓度测定试剂盒；丝裂霉素-C（10 mg/支）。

1.3 大鼠代膀胱模型

取下腹正中切口，距盲肠2～3 cm近端游离一段血供较好的末端回肠（带血管蒂），截取后以直径相当于6-0可吸收线的慕丝线对回肠进行端端吻合，恢复其连续性。距膀胱三角区0.3 cm处切除大部分膀胱，将新膀胱以“U形吻合法”吻合于膀胱残端。逐层关闭腹腔，术后至膀胱灌药结束前大鼠若有死亡，立即重新造模补齐。

1.4 膀胱灌药方式

模型建立后的第8、11、14天向NS组大鼠代膀胱注入生理盐水1 ml；向MMC组注入配制好的0.6 mg/ml丝裂霉素溶液1 ml；上述两组大鼠灌药完毕后保留2 h。

1.5 实验观察指标的采集以及留取标本

模型建立后的第8、11、14天灌注丝裂霉素-C留取尿液标本，第17天最后一次留取尿液标本后处死大鼠，取代膀胱组织，中性甲醛固定，常规石蜡包埋。

1.6 肠黏膜形态学观察

观察回肠黏膜层及黏膜下层的组织结构，判定肠黏膜损伤情况采用回肠黏膜评分：绒毛完全坏死（4分）；绒毛中部坏死，肠隐窝清晰可见（3分）；绒毛坏死，局限于顶部（2分）；轻度肠上皮脱落（1分），仅限于黏膜顶部；肠组织正常无坏死（0分）。

1.7 黏液组化染色（AB-PAS）

黏蛋白含多糖，羧酸化（唾液酸）的黏蛋白呈蓝色。每个标本选择5个绒毛，计算蓝染杯状细胞数以及总杯状细胞数，取平均值。

1.8 Muc-2免疫组化染色

制备石蜡切片，用SABC法进行免疫组织化学染色。每例观察切片一张，随机选取5个非重叠的视野进行观察计数，计算视野内阳性杯状细胞数。

1.9 统计学处理

采用SPSS 10.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANONA），多组连续变量资料采取秩和检验（Kruskal-Wallis Test），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMC药物对尿液内黏蛋白浓度的影响

MMC组在术后第11、14、17天与NS组同时间点相比差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 MMC药物对尿液内唾液酸浓度的影响

MMC组在术后第11、14、17天与NS组同时间点相比差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3 MMC药物对代膀胱及正常回肠杯状细胞数目的影响

AB-PAS染色光镜下总杯状细胞数：MMC组与NS组相比有显著性差异（P<0.05）；MMC组AB-PAS蓝染杯状细胞/总杯状细胞比例与NS组相比，有显著性差异（P<0.05）；MMC组MUC-2免疫组化染色杯状细胞数与NS组相比，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

2.4 MMC药物对代膀胱及正常回肠组织形态学的影响

从HE切片观察到，MMC组肠黏膜及黏膜下层损伤有限，多数肠绒毛中下部结构完整。NS组肠黏膜结构完整。NS组回肠黏膜评分均为0分；MMC组0分1例、1分4例、2分3例，3分2例。MMC组（平均秩24.88）与NS组（平均秩10）相比，差异有统计学意义（字2=32.62，P<0.01），见表4。

表4 回肠黏膜评分

组别0分（例）1分

（例）2分

（例）3分

（例）4分

（例）平均秩

NS组（n=10）10000010

MMC组（n=10）1432024.88

3 讨论

膀胱全切尿流改道后由新膀胱形成黏液栓所带来的并发症可以引起诸多早期并发症，比如感染、导尿管或造瘘管堵塞、尿瘘，此外还有结石、肾功能损害、间歇清洁导尿难度增大以及新膀胱破裂等一些远期并发症[4]。有学者报道，在全身应用化疗药物时能抑制肠道黏膜细胞分裂、增殖，导致萎缩、脱落、肠绒毛减少[5]。本实验在预实验的基础上确定了膀胱灌注MMC的剂量（0.6 mg/ml），即：在不过度损伤肠黏膜上皮的前提下，降低尿液中黏蛋白的浓度。

通过HE染色观察发现，MMC组肠黏膜上皮损伤较轻，仅限于肠绒毛上段，小肠腺及肌层未遭到明显破坏。对回肠黏膜的评分经过秩和检验也进一步证实了此结论。

通过测定尿液中黏蛋白浓度，发现MMC可以显著的降低尿液中黏蛋白浓度。黏蛋白浓度下降，意味着尿液中黏液的黏度下降，对改善患者术后的尿流动力学、降低黏液栓的发生率有积极的意义[6]。有研究指出，若使用酶或混合酸水解去除唾液酸，可以使黏液的黏度大幅度降低[7]。

实验还发现两组都出现了不同程度的肠黏膜上皮水肿、杯状细胞增生伴肥大现象。目前国内外均有学者认为：术后早期在尿液刺激、环境改变、手术应激等因素的综合因素下，储尿囊的杯状细胞数量会出现增多[8]。

通过上述讨论，结合本实验的实验结果，总结如下：0.6 mg/mlMMC灌注大鼠代膀胱干扰了储尿囊肠黏膜上皮的修复过程，可有效降低术后早期（17 d）尿液中黏蛋白以及唾液酸浓度，降低成熟杯状细胞比例；术后早期肠绒毛出现肿胀、中央乳糜管扩张、杯状细胞出现增生及肥大是灌注MMC、术后血浆白蛋白水平下降、术后低血容量、肠黏膜上皮重建、细胞缺血缺氧、尿液新环境等综合因素共同作用的结果，但详细机制有待进一步的研究。

参考文献

[1]郭艳辉，赵惠，任芳.丝裂霉素膀胱灌注治疗膀胱癌1例[J].中国实用医药，2010，12（36）：182.

[2]范治璐，于洋，刘志宇，等.回肠代膀胱患者肠膀胱黏液所致并发症相关问题分析[J].中国医科大学学报，2011，40（9）：830-831.

[3]汪泽厚，周高标，洪泉，等.乙状结肠直肠膀胱术的并发症及预防[J].临床泌尿外科杂志，2010，25（1）：38-39.

[4]高峰，赵晓昆.全膀胱切除术后不同尿流改道术式的疗效比较[J].现代中西医结合杂志，2014，23（22）：2441-2442.

[5]张敏，陈锦秀，谭景予，等.化疗致胃肠道黏膜炎动物模型构建方法的研究进展[J].世界华人消化杂志，2012，20（8）：649-655.

[6]廖洪，肖英明，杨盛柯，等.黏蛋白7检测在膀胱癌诊断中的价值[J].中华泌尿外科杂志，2014，35（4）：274-275.

[7]陈晓玲，武锦彪，俞倩，等.2型糖尿病及其并发症患者血清唾液酸检测意义[J].实验与检验医学，2013，31（2）：159-161.

[8]胡艳艳.肠道杯状细胞结构和功能的研究进展[J].国际病理科学与临床杂志，2013，33（5）：424-430.

（收稿日期：2015-07-10） （编辑：金燕）