一株生物乳化剂产生菌的筛选及其特性研究

材料与方法

2.1 土壤样品

本实验所用土样采集自滨州地区石油开采区。

2.2 实验材料

富集培养基[7，8]：K2HPO44.35 g，KH2PO41.7 g，NH4CL2.1 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，FeSO4·7H2O0.01 g，CaCl2·2H2O0.03 g，石蜡5%。

发酵培养基[7，8]：K2HPO4·3H2O4.8 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41 g，柠檬酸三钠0.5 g，MgSO4·7H2O0.2 g，葡萄糖2 g，酵母提取物0.1 g，CaCl2·2H2O0.002 g，MnCl2·4H2O0.0004 g，NiCl·6H2O0.0004 g，ZnSO4·7H2O0.0004 g，FeCl3·6H2O0.0002 g，NaMoO4·2H2O0.0002 g，pH值7.2蒸馏水1 000 mL。

2.3 生物乳化剂产生菌的富集和纯化

称取定量土样于液蜡培养基中进行富集。培养温度37℃，180r/min，摇床震荡培养，时间7 d，富集3～5次。将富集液进行稀释涂布，培养基采用LB培养基分离纯化。将分离得到的菌株进行分离纯化以备后期乳化性能的测定。

2.4 乳化性能的测定

将分离到的菌株接种到LB液体培养基中，37℃，180r/min摇床过夜培养。在试管中加入3 mL柴油作为测试烃和7mL培养液，涡旋振荡器充分振荡1 min，静止2 h，以乳化指数（EI24=乳化层高度/有机相总高度）[9，10]表示乳化剂的乳化活性。

2.5 菌株的鉴定

2.5.1 生理生化反应检测

参考常见细菌系统鉴定手册测定。

2.5.2 菌株16S rRNA鉴定

将筛选得到的菌株进行DNA的提取后，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R来扩增16S rRNA基因序列。PCR反应体系的反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min[11]。扩增产物经电泳检测后送北京生物工程公司检测。序列用于系统发育树作图。

2.6 产生物乳化剂菌株最适生长条件分析

将分离得到的目的菌株接种到发酵培养基中，37℃，180 r/min摇床震荡过夜培养后测定其对柴油的乳化作用。将发酵培养基的初始pH值分别调为7、8、9、10、11、12，初始盐浓度调为0%～9%，接种目的菌株，37℃，180 r/min摇床震荡过夜培养后测定其乳化指数及在600 nm波长下的OD值，以未接菌的空白培养基作为对照[12]。

2.7 生物乳化剂的分离

将目的菌株进行发酵培养，发酵液经10 000 r/min离心10 min，除去菌体。上清液中缓慢加入（NH4）2SO4至75%饱和度，4℃冰箱过夜沉淀。9 000 r/min离心15 min除去上清，沉淀重溶于少量蒸馏水，经冷冻干燥后获得絮状固体即为乳化剂粗制品[13]。

2.8 生物乳化剂理化性质分析

（1）乳化剂的乳化浓度范围：将乳化剂样品溶于ddH2O中，分别稀释为5 mg/L、4.5 mg/L、4 mg/L、3.5 mg/L、3 mg/L、2.5 mg/L、2 mg/L、1.5 mg/L和1 mg/L，检测其乳化活性，测试乳化剂作用浓度范围。

（2）生物乳化剂的糖类组分的定性检测采用硫酸-蒽酮显色法，脂类组分的定性检测采用钼酸铵一高氯酸显色法，蛋白质组分的定性检测采用水合茚三酮显色法。根据苯酚-硫酸法、氯仿/甲醇法、考马斯亮蓝法对乳化剂中糖、脂和蛋白含量进行定量测试。

3 结果与分析

3.1 菌株的分离筛选

经过富集培养和分离纯化，从滨州地区石油开采区的石油污染土壤中分离获得4株菌，其中菌株SJ在发酵培养基中产乳化剂能力最强，乳化指数为100%（图1）。

3.2 菌株SJ的鉴定

菌株SJ在LB平板上的菌落呈圆形，边缘整齐，产色素，橘黄色。革兰氏染色呈阴性，菌体近球状，不产芽孢，无荚膜。生理生化检测表明，该菌株为兼性好氧菌，甲基红试验为阴性，不水解尿素，能利用柠檬酸盐，淀粉水解与纤维素水解为阴性，V-P试验为阴性。提取其基因组，并扩增16S rRNA基因，经测序得到1 500bp左右的基因序列，与NCBI中的序列进行比对发现该菌株与菌株Serratia sp. SCH-1（KJ584612.1）同源性最高（图2），序列相似性为99%，初步判定菌株SJ属于沙雷氏菌属，命名为Serratia sp. SJ。

3.3 SJ菌株的最适生长条件

测试了菌种SJ在不同的pH值条件下、不同NaCl浓度下的生长情况，结果发现菌株SJ在pH值7～12的范围内都能够生长，最适生长pH值为8.0；在NaCl浓度为0～4%的范围内生长良好（图3、图4）。

3.4 菌株SJ产生物乳化剂的发酵时间

在菌株SJ发酵培养的最适条件下进行发酵培养，每隔2 h，取菌液测定乳化指数，结果如图5所示，菌株生长22 h以后，发酵液的乳化指数达到100%。

3.5 菌株SJ产生的生物乳化剂的提取

发酵培养SJ菌株，将发酵液离心除去菌体，将上清用饱和（NH4）2SO4至进行沉淀，4℃冰箱过夜沉淀，9 000 r/min离心15 min除去上清，将沉淀透析后冷冻干燥。2L发酵液中提取出乳化剂1.5 g，得率为0.75 g/L。

将得到的生物乳化剂配制成不同浓度的样品，分别测试乳化能力，如图6所示，结果表明 乳化剂浓度大于2 mg/mL乳化指数均为100%，说明有效提取了菌株SJ产生的生物乳化剂。

3.6 菌株SJ产生的生物乳化剂的定性定量分析

对菌株SJ产生的生物乳化剂进行定性和定量分析，采用硫酸-蒽酮显色法检测发现，生物乳化剂样品和对照组（D-果糖）均呈现蓝绿色，表示该生物乳化剂中含有糖组分；水合茚三酮显色实验中，乳化剂样品呈现粉红色，表示该生物乳化剂中含有蛋白质成分；钼酸铵-高氯酸显色反应中发现样品和对照组（橄榄油）均呈现蓝黑色反应，表示该生物乳化剂中含有脂质成分。定量分析结果表明，三种组分的含量分别为34.7%、41.6%和16.0%。

4 结论

本实验从石油污染盐碱土中分离得到一株产生物乳化剂的菌株SJ，经鉴定该菌株属于沙雷氏菌。该菌株对pH值与盐度均有很强的耐受性，pH值耐受范围为7～10，NaCl的最适生长浓度范围为0～4%。采用盐沉法提取了菌种SJ发酵液中的生物乳化剂，得率为0.75 g/L，该乳化剂含有糖、蛋白和脂类三种成分，比例为34.7%、41.6%和16.0%。菌株SJ及其产生的生物乳化剂在石油污染土壤的生物治理、微生物采油等方面具有应用前景。

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