SRB法检测没食子酸乙酯对PC12细胞的毒性作用

材料

1.1 药物、细胞株与主要试剂

没食子酸乙酯（购自阿拉丁，E119029）；小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株PC12（上海细胞生物研究所细胞库）；Sulforhodamine B（Sigma，批号230162），胚胎牛血清（FBS，Thermo，批号SV30087.02）；DMEM（Life，12800-017）。

1.2 主要仪器

CO2培养箱（Thermo，型号：3111），倒置显微镜（Olympus，型号：IX53），酶标仪（Bio Tek，型號：Elx808）

2 方法

2.1 细胞培养

PC12细胞置37℃、5%CO2的培养箱中，用含10% FBS的高糖DMEM培养液培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 SRB法检测没食子酸乙酯对PC12细胞的毒性

取对数生长期PC12细胞，胰酶消化，调整浓度为10000个/mL的单细胞悬液并接种于96孔培养板，100μL/孔，24h后加入含不同浓度没食子酸乙酯培养液，对照组加入等体积溶剂培养液，每组设6个复孔（重复3次），置培养箱中培养72h，终止时弃培养液，加入100μL预冷的10%TCA固定，4℃冰箱置1h。弃固定液，清水洗3次，甩干干燥，每孔加入100μL0.4%SRB室温作用30min，用1%冰醋酸洗去游离染料。甩干干燥，每孔加入100μL10mM Tris溶解，放摇床直至染料全部溶解。最后用酶标仪在564nm波长处测定OD值。细胞抑制率%=（1-实验组平均OD/对照组平均OD）×100%

2.3 统计学处理

采用SPSS11.5进行统计学处理。计量资料以x±s表示。组间比较采用配对t检验。

3 结果

由表1结果显示，不同浓度的没食子酸乙酯对PC12细胞的增值均有不同程度的抑制作用，并随浓度增加，抑制率增大即细胞存活个数越少（图1），其中1.25μg/mL～5μg/mL浓度范围对PC12细胞的毒害最小。

4 讨论

磺基罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）是一种蛋白质结合染料，可与生物大分于中的碱性氨基酸结合，其颜色变化与活细胞蛋白成正比。SRB法不仅具备MTT法操作简便、敏感的特点，而且测量结果不受时间影响，特别适用于大规模药物筛选及毒性评价。

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，属神经嵴源性，具神经内分泌细胞的一般特征，且具可传代特点，能够代替原代培养的神经细胞[2]，广泛应用于神经生理、药理学研究。

没食子酸乙酯作为一种抗氧化剂，神经细胞的氧化应激损伤具有一定保护作用，但其有一定细胞毒性，本研究采用SRB法进一步评价其对PC12细胞的毒性作用。结果显示不同浓度的没食子酸乙酯对PC12细胞的增值均有不同程度的抑制作用，且呈剂量依赖性，其中1.25μg/mL～5μg/mL浓度范围对PC12细胞的毒害最小。

【参考文献】

[1]田伟，毕玉婷，周启龙，等.没食子酸酯对神经细胞的抗氧化保护作用研究[J].天然产物研究与开发，2013，25：1423-1427.

[2]黄文超，李云峰，罗质璞.单胺递质对皮质酮所致的PC12细胞损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2003，19（1）：103-106.

[责任编辑：汤静]