木犀草苷对3T3—L1前脂肪细胞分化的抑制作用

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[摘要] 目的 观察木犀草苷对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用。 方法 用噻唑蓝（MTT）法检测木犀草苷对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响；用鸡尾酒法诱导3T3-L1细胞分化，用油红O染色、三酰甘油含量检测脂肪细胞分化程度；采用RT-PCR和Western blot方法检测木犀草苷对脂肪细胞过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）mRNA和蛋白表达的影响。 结果 木犀草苷5～80 μmol/L不影响细胞活性，160～320 μmol/L显著抑制细胞活性，呈剂量依赖性抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，显著降低脂肪细胞PPARγ、C/EBPα mRNA和蛋白的表达。 结论 木犀草苷能抑制3T3-L1前脂肪细胞分化，减少脂质聚集，是通过下调PPARγ、C/EBPα的表达实现的。

[关键词] 木犀草苷；3T3-L1前脂肪细胞；分化；PPARγ；C/EBPα

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（b）-0016-04

Inhibitory effect of galuteolin on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte

LI Huiling1 WU Xiao2 WANG Dan3 ZHANG Qiuhua1

1.Staff Room of Basic Pharmacology， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang 110847， China； 2.Experimental Animal Center， He University， Liaoning Province， Shenyang 110163， China； 3.Staff Room of Histology and Embryology， Basic Medical College， Jinzhou Medical University， Liaoning Province， Jinzhou 121001， China

[Abstract] Objective To observe the inhibitory effect of galuteolin on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte. Methods The effect of galuteolin on the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte was detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）； the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte was induced by the cocktail method， the differentiation degree of preadipocyte was detected by oil red O staining and the content of triacylglycerol； the effects of galuteolin for the mRNA and protein expression of peroxisome proliferator activated receptor-γ （PPARγ） and CCAAT/enhancer binding protein α （C/EBPα） were measured by RT-PCR and Western blot. Results The concentration of 5-80 μmol/L galuteolin did not affect the cell activity， 160-320 μmol/L galuteolin could significantly inhibit the cell activity， which could significantly inhibit the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte in a dose-dependent manner and decrease the mRNA and protein expression of PPARγ and C/EBPα. Conclusion Galuteolin can inhibit the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte， reduce the lipid accumulation， which may be realized by down-regulating the expression of PPARγ and C/EBPα.

[Key words] Galuteolin； 3T3-L1 preadipocyte； Differentiation； PPARγ； C/EBPα

肥胖是高血壓病、2型糖尿病、心血管疾病、癌症等的高危诱发因素，已成为快速增长并蔓延全球的公共健康威胁[1-5]，它是由遗传、环境等特定因素引起的进食调控和能量代谢紊乱，使脂肪积聚过多、体重超常的内分泌代谢疾病。近年来研究发现，姜黄素、白藜芦醇、槲皮素等黄酮类化合物有较好的减肥作用[7]。木犀草苷是豆茶决明、金银花、荆芥等植物中的天然黄酮类化合物[6]。笔者前期研究发现，豆茶决明有减肥作用[8]，其中包含黄酮类化合物木犀草苷。本研究主要探讨木犀草苷对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

VARIOSKAN FIASH酶标仪（Thermo Scientific）；CKX41倒置生物显微镜（中国OLYMPUS有限公司）；HERAcell 150i细胞培养箱（Thermo Scientific）；YJ-VS超净工作台（天锡一净净化设备有限公司）；Hema480基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司）；DYY-8B稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）；PE2400型多功能PCR仪（美国Perking公司）。

1.2 主要试剂

3T3-L1前脂肪细胞（复旦IBS细胞资源中心FDCC）；木犀草苷（北京索莱宝科技有限公司，纯度≥98%，批号20150511）；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、胰岛素（Ins）（北京索莱宝科技有限公司，批号20151118、822A0522、601C022）；油红O染液（西安赫特生物科技有限公司，批号20151103）；噻唑蓝（MTT）、兔抗-PPARG多克隆抗体、兔抗-CEBPA多克隆抗体（上海碧云天生物科技有限公司，批号0101181501、20151208、20160123）；三酰甘油（TG）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号20160108）；兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K156911D）。PCR引物委托上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 “鸡尾酒诱导法”诱导3T3-L1前脂肪细胞分化

参考Ariemma等[9]的方法，将3T3-L1前脂肪细胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养液在5%CO2、37℃培养箱培养，细胞100%融合后，再培养2 d，换上含有10% FBS、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX和10 μg/mL Ins的DMEM培养液培养2 d，更换含有10% FBS和10 μg/mL Ins的DMEM培养液培养，2 d后更换含10% FBS的DMEM培养液，至分化完成。木犀草苷在每次诱导时同时加入。

1.4 MTT法检测木犀草苷对细胞增殖的影响

收集对数生长期细胞，以每孔1×104个细胞接种到96孔板中。5%CO2、37℃培养48 h后，加入0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L的木犀草苷，设24、48、72、96 h时间点，MTT法，490 nm测定吸光值[10]。

1.5 油红O染色检测细胞分化和脂质含量

诱导3T3-L1细胞分化的同时，分别加入5、20、80 μmol/L的木犀草苷，11 d后，用0.01 mol/L PBS洗2次，按油红O染液说明书操作，倒置显微镜观察脂滴并拍照。然后加入100%异丙醇，溶出油红，510 nm测吸光值[11]。

1.6 TG含量检测

3T3-L1细胞按“1.3”分化加药11 d后，用0.01 mol/L PBS洗2次，蛋白裂解液裂解，用细胞刮收集细胞，TG测试盒测定TG含量。用BCA蛋白试剂盒定量裂解液中蛋白含量。

1.7 RT-PCR检测成脂分化基因的表达

按“1.3”分化处理11 d后，用BEYOZOL试剂提取总RNA，用基因扩增仪将RNA逆转录成cDNA。RT-PCR的相关基因引物序列见表1[10]。

1.8 Western blot检测分化基因的表达

收集诱导分化的细胞，Western blot方法[12]测定PPARγ、C/EBPα的蛋白表达。以β-Actin为内参。

1.9 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草苷對3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

木犀草苷在5～160 μmol/L浓度时对细胞增殖没有影响，在给药72、96 h后，160～320 μmol/L浓度能降低前脂肪细胞的增殖和细胞活性（图1）。后续选择5、20、80 μmol/L剂量，研究其对3T3-L1前脂肪分化的影响。

2.2 木犀草苷对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

油红O染色结果显示，木犀草苷5、20、80 μmol/L组所含红色“戒环”样脂滴数和TG含量较对照组明显减少（图2～3），表明其可明显抑制3T3-L1前脂肪细胞分化。

2.3 木犀草苷对脂肪分化相关基因表达的影响

C/EBPα和PPARγ是前脂肪细胞分化的关键调控因子。图4～5结果表明木犀草苷各剂量组均能显著下调3T3-L1前脂肪细胞C/EBPα和PPARγ mRNA和蛋白的表达水平。

3 讨论

肥胖发生源于脂肪组织的大量聚集，是由脂肪组织细胞数量增多和体积增大引发的，是前脂肪细胞增殖分化的结果[13-14]。本研究结果表明，木犀草苷浓度在5～80 μmol/L不影响细胞活性，在160～320 μmol/L显著抑制细胞活性，降低脂质的沉积，减少TG含量。这些结果表明，木犀草苷能抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。

脂肪生成是由转录因子激活的信号转导通路严格监控的复杂过程[15-16]，涉及最核心转录因子PPARγ、CCAAT增强子结合蛋白（C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ）的调控。C/EBPβ和C/EBPδ在分化的早期表达，诱导PPARγ和C/EBPα的表达。PPARγ和C/EBPα协同作用，激活脂肪细胞特异性基因表达导致脂肪细胞最终的分化，脂滴形成[17-22]。本研究发现，木犀草苷能显著降低PPARγ和C/EBPα mRNA和蛋白的表达，因此，笔者推测木犀草苷是通过抑制PPARγ和C/EBPα的表达而降低3T3-L1细胞分化和TG含量。

本研究通过“鸡尾酒法”诱导3T3-L1前脂肪细胞分化，提示木犀草苷能抑制前脂肪细胞分化，降低脂质沉积，机制与抑制脂肪细胞分化的关键转录因子C/EBPα和PPARγ的表达有关。此机制为木犀草苷在脂类代谢中的作用提供了理论依据。

[参考文献]

[1] 王玉林，张丽，何佳，等.新疆偏远农村地区成年人血压与肥胖指标的关系[J].中华高血压杂志，2016，24（7）：650-656.

[2] 徐远，段军，王艳梅，等.超重肥胖2型糖尿病病症规律探讨[J].中华中医药杂志，2013，28（8）：2423-2425.

[3] 刘晓强.肝X受体-肥胖与心血管疾病的共同基因通路[J].中国分子心脏病学杂志，2016，16（1）：1621-1624.

[4] 张楠楠，高超，邱渝杰.肥胖与癌症关系的临床研究最新进展[J].医学综述，2014，20（8）：1401-1403.

[5] Abente EJ，Subramanian M，Ramachandran V，et al. MicroRNAs in obesity-associated disorders [J]. Arch Biochem Biophys，2016，589：108-119.

[6] 管仁伟，曲永胜，顾正位，等.木犀草苷的药理作用研究[J].中国野生植物资源，2014，33（1）：1-3.

[7] Babu PV，Liu D，Gilbert ER. Recent advances in understanding the anti-diabetic actions of dietary flavonoids [J]. J Nutr Biochem，2013，24（11）：1777-1789.

[8] 杨楚枫，杨洋，张玥，等.豆茶决明对高脂诱导C57BL/6J小鼠肥胖和胰岛素抵抗的研究[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（10）：141-145.

[9] Ariemma F，D"Esposito V，Liguoro D，et al. Low-dose bisphenol-a impairs adipogenesis and Generates Dysfunctional 3T3-L1 adipocytes [J]. PLoS One，2016，11（3）：e0150762.

[10] Li KK，Liu CL，Shiu HT，et al. Cocoa tea（Camellia ptilophylla）water extract inhibits adipocyte differentiation in mouse 3T3-L1 preadipocytes [J]. Sci Rep，2016，6：20172.

[11] Ogra Y，Nagasaki S，Yawata A，et al. Metallomics approach to changes in element concentration during differentiation from fibroblasts into adipocytes by element array analysis [J]. J Toxicol Sci，2016，41（2）：241-244.

[12] Jiao Y，Sun KK，Zhao L，et al. Suppression of human lung cancer cell proliferation and metastasis in vitro by the transducer of ErbB-2.1（TOB1）[J]. Acta Pharmacol Sin，2012，33：250-260.

[13] Han R，Wang X，Bachovchin W，et al. Inhibition of dipeptidyl peptidase 8/9 impairs preadipocyte differentiation [J]. Sci Rep，2015，5：12348.

[14] Rosen ED，Spiegelman BM. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis [J]. Nature，2006，444：847-853.

[15] Siersbk R，Nielsen R，Maup S. Transcriptional networks and chromatin remodeling controlling adipogenesis [J]. Trends Endocrinol Metab，2012，23（2）：56-64.

[16] Guo L，Li X，Tang QQ. Transcriptional regulation of adipocyte differentiation：a central role for CCAAT/enhancer-binding protein（C/EBP）β [J]. J Biol Chem，2015，290：755-761.

[17] 李萌，柏友萍，陳晨，等.运动与共轭亚油酸对青春期肥胖大鼠PPARγ的影响[J].卫生研究，2015，44（2）：179-184.

[18] White UA，Stephens JM. Transcriptional factors that promote formation of white adipose tissue [J]. Mol Cell Endocrinol，2010，318：10-14.

[19] 张婷，王铁鹏，刘宗智，等.下调MSCp43抑制前脂肪细胞分化[J].石河子大学学报：自然科学版，2016，34（2）：187-193.

[20] 柏友萍，李萌，崔建飞，等.不同强度运动结合共轭亚油酸对肥胖大鼠内脏脂肪组织PPARγ表达和血浆PPARγ含量的影响[J].中国运动医学杂志，2015，34（12）：1197-1201.

[21] Farmer SR. Transcriptional control of adipocyte formation [J]. Cell Metablism，2006，4（4）：263-273.

[22] Kajimura S，Seale P，Tomaru T，et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex [J]. Genes Dev，2008，22（10）：1397-1409.

（收稿日期：2016-11-01 本文编辑：张瑜杰）