丹参治疗OSF的病理学形态及微血管密度变化的研究

【摘要】目的:探讨丹参注射液在OSF中的治疗作用和可能的作用机制，为此病的治疗开辟新途径。方法:从上皮、间质、腺体和肌组织四方面观察早、中、晚期OSF治疗前后病理学形态和微血管的数量及密度的变化。结果:病理形态和微血管密度显示丹参治疗后各期OSF有明显疗效，差异有统计学意义（P＜0.01）;OSF组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论:丹参治疗OSF有明显疗效，对血管内皮细胞具有保护作用，值得临床进一步研究和推广。

【关键词】口腔粘膜纤维病变；微血管；丹参

【中图分类号】R781.59 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455（2010）11-0028-03

Study on the pathology and themicrovessel density of Danshen treatment OSF

Lu LianmingWen WenZhou YanLi ShaLiu Ming

【Abstract】Objective:To observe the change of morphological and microvessel number and density before and after therapeutic and the effect of using Danshen injection on OSF.Methods: (1)OSF were observed including in the epithelium, interstitial tissues, glands and muscle tissue through the conventional pathological method，exminated the microvessel number.Results: The results of pathological examination and microvessel density showed that the Danshen had after treatment showedmarked effect on OSF, the difference was statistically significant (P<0.01); there was no signficant between group comparison (P>0.05). Conclusion: Danshen has significant effect on the treatment of OSF，Danshen play a protective role on vascular endothelial cells.

【Key words】oral submucous fibrosis; microvessel; Danshen

1材料与方法

1材料 根据患者的知情同意，按Pindborg的OSF病理学分期标准及临床表现[1],选用2004年1月至2008年10月间在我院口腔门诊就诊并经病理确诊的30例（早、中、晚各10例）OSF，患者全为男性，平均年零35.5岁，病程5月至8年。另取10例无不良嗜好的健康自愿者的口腔粘膜作为正常对照组。接受治疗的30名患者进行治疗前和丹参注射液治疗后活检，活检组织按病理常规处理后，分别HE和CD34染色。

2方法

2.1临床治疗方法:对30例OSF患者进行双颊部、双翼部下颌韧带、上腭两侧点状注射丹参注射液，总剂量4 ml/次，1次/周，平均注射10次，每次治疗后记录患者主诉症状和张口度、病损改变情况，停药3月后活检。

2.2免疫组化染色步骤及微血管计数:标本经4%甲醛固定后按常规处理，3um连续石蜡切片于60℃烤箱中烘烤3h，脱蜡至水化，按迈新公司ElivisonTM操作步骤[2、3]进行鼠单抗CD34染色后镜检。实验用人肺组织作阳性对照，用非免疫动物血清替代一抗作阴性对照。免疫组化评定标准采用双盲法，在光镜下随机取5个视野，计算每个视野血管数量。凡由内皮细胞或幼稚内皮细胞形成的管状、窄隙状、囊状和空泡状染色为棕黄色结构判定为可计数MVD，但管腔直径大于8个红血球直径的总和，以及坏死区的微血管和厚壁血管不计入总数内，按此方法由2名病理医师分别在光镜低倍下选取MVD密度最大的3个区，再在200倍视野下对微血管进行计数，取2人计数的均值作为MVD值，经SPSS122.0 for windows统计程序统计学分析，治疗前后各组微血管密度的比较采用t检验。

2结果

2.1丹参治疗后OSF病理学形态[4，5]

2.1.1早期治疗前：粘膜上皮萎缩、钉突变短、肥大或部分消失，棘层轻度增生肥厚，粘膜间质水肿、胶质纤维玻璃变性，血管扩张或狭窄，血管周中性粒细胞、淋巴细胞浸润。治疗后接近正常口腔粘膜组织（图1）。

2.1.2中期治疗前：粘膜表面角化，钉突消失，棘层少数细胞空泡变，粘膜下胶原纤维玻璃变性、染色加深、细胞成分减少；扩张的血管周大量淋巴细胞、浆细胞浸润，肌纤维变性；治疗后上皮棘层仍可见少量空泡细胞，肥大的钉突形成，肌纤维及肌组织变性较治疗前减轻，纤维束较稀，新生血管形成，腺体有少量的炎细胞浸润（图2）。

2.1.3晚期治疗前：上皮各层出现细胞空泡变，以棘层较密集，钉突消失，胶原全部璃变，折光性强，血管狭窄或闭塞，血管周炎细胞浸润；肌组织变性断裂，腺体和肌组织间可见淋巴细胞和浆细胞浸润。治疗后：固有层及粘膜下层的胶原染色变浅，致密的纤维束变稀疏，毛细血管增生，炎性细胞浸润减少（图3）。

2.1.4治疗后各组微血管密度计数（X±S表示）：阳性对照组织和正常口腔颊部粘膜均可见黄棕色阳性的微血管。OSF早期上皮内显示少量微血管，间质及肌组织内可见明显的微血管（图4），中、晚期上皮内无明显的微血管存在，间质及肌组织、腺体内微血管明显减少、狭窄或闭锁；治疗后各组可见明显新生微血管（图5、6），与治疗前比较，差异有统计学意义。见表1

图1早期OSF治疗前后HE染色 HE×200

图a治疗前-粘膜上皮萎缩，钉突变短或部分消失，钉突肥大，棘层轻度增生肥厚，:粘膜下间质出现水肿、玻璃变性带胶原纤维，血管扩张充血或血管狭窄，血管周围及腺体间有中性粒细胞、淋巴细胞浸润；图b OSF治疗后-上皮、腺体及肌组织均接近正常组织。

图2：中期OSF治疗前后HE染色 HE×200

图c治疗前-粘膜表面角化，钉突消失，棘层少数细胞空泡变性，胶原纤维玻璃变性逐渐加重，扩张的血管周围有中量淋巴细胞、浆细胞浸润，肌纤维有变性，腺体减少，炎性细胞增多；图d 治疗后-表皮棘层可见极少数细胞空泡变性，肥大钉突形成，胶原纤维及肌组织无变性，新生血管形成，腺体增多，腺体间炎细胞减少，新生血管形成。

图3：OSF晚期治疗前后HE染色 HE×200

图e:治疗前-上皮各层内出现空泡变性，以棘层较为密集，上皮钉突消失；胶原全部玻璃变性，正常结构消失，折光性强，血管狭窄或闭塞，肌组织变性、断裂，腺体和肌组织间有淋巴细胞和浆细胞浸润,腺体间质纤维化；图f：治疗后-上皮棘层细胞无空泡变性，结缔组织和肌组织变性明显减轻，有新生血管形成，腺体数量增多，血管周围、腺体和肌组织间炎细胞减少。

图4早期OSF治疗前后粘膜、间质血管内皮细胞CD34表达SP×200

g：治疗前- 上皮、间质、肌组织及腺体间血管内皮细胞CD34阳性；h：治疗后-上皮、间质、肌组织及腺体血管内皮细胞CD34阳性

图5中期OSF治疗前后间质血管内皮细胞CD34表达SP×200

i：治疗前-间质、肌组织及腺体间血管内皮细胞CD34阳性； j：治疗后-间质、肌组织及腺体间血管内皮细胞CD34阳性

图6晚期OSF治疗前后间质血管内皮细胞CD34表达SP×200

l：治疗前-间质血管内皮细胞、腺体及肌组织间血管内皮细胞CD34阳性；n：治疗后-间质血管内皮细胞、腺体及肌组织间血管内皮细胞CD34阳性

3讨论

口腔粘膜纤维病变（oral submucous fibrosis,OSF）是一种口腔粘膜慢性、进展性、具有癌变潜能的疾病，可能与槟榔果、免疫、细胞因子等高度有关[6-8]。目前OSF的诊断并不难，其治疗OSF的方法较多，如皮质激素、高压氧、外科手术治疗等，但疗效不佳。因此，寻找副作用小，安全有效的方法已成为OSF治疗学研究的热点，我们用丹参注射液治疗的OSF患者，经二年的追踪随访，可能是因没有戒除咀嚼槟榔果和烟酒的原因，中期、晚期各有1例复发。其余患者都取得明显疗效。本实验通过观察丹参治疗前后OSF病理学的形态和微血管密度的改变证实丹参具有良好的临床治疗作用，可能与丹参对血管内皮细胞的保护机制相关。

3.1丹参对OSF微血管及各组织有保护作用。丹参的化学成份主要有脂溶性二萜醌和水溶性酚性酸两大类，丹参注射液为丹参的水液性部分，具有活血化淤、扩张外周血管、增加血流量，提高NK、LAK活性、提高血小板内CAMP水平抑制TXA2的合成、促进组织修复与再生，成纤维细胞的增殖和胶原的合成、增加机体耐氧能力、改善微循环及抗凝作用。本研究通过对丹参30例治疗前、后OSF患者进行病理学对比观察，发现治疗前早期OSF即出现明显血管有扩张、畸形改变，粘膜上皮萎缩、钉突短甚至消失、固有层及粘膜下层水肿、胶原纤维玻变、但肌组织和腺体未见明显的改变；到中、晚期OSF组织血管出现狭窄甚至闭塞、上皮角化、钉突完全消失，胶原纤维玻变加重、肌组织出现变性、断裂、腺体纤维包膜增厚等形态改变。OSF患者用丹参治疗8至10次治疗后，病理学和MVD显示：丹参治疗后各组均可见明显的新生微血管，与正常组相比较，治疗后中期组与治疗前中期组比较，差异有统计学意义。从病理学形态和微血管密度的变化证实丹参对OSF有良好的临床治疗作用。

3．2丹参对OSF的血管内皮细胞保护效应及机制本研究通过病理形态观察发现OSF中、晚期微血管数量、密度明显减少，引起口腔粘膜下组织出现缺血、缺氧，从而影响角朊细胞的生长，由于外界因素直接和低氧均引起VEC的损伤，而导致异常分泌NO、ET、TGFB1、PDGF等血管活性物质，并通过上述分泌的细胞因子调节成纤维细胞的增殖，参与OSF 的发生。丹参治疗组血管基膜完整，内皮及血管周细胞结构清晰、染色质分布均匀。我们推测丹参对OSF血管内皮细胞的保护机制可能是通过:（1）清除氧自由基，丹参注射液中的丹参素是一种较强的超氧阴离子清除剂，丹参酮能清除线粒体膜脂质过氧化作用产生的脂质自由基，保护细胞膜。（2）保护线粒体，改善能量代谢。线粒体是能量代谢和自由基产生的主要场所，自由基相互作用，互为因果，促进细胞的损伤。（3）减轻钙超负荷，调节钙稳定。钙超载可造成能量代谢障碍，促进氧自由基的大量产生，增加膜磷脂的分解[7]。丹参可抑制细胞内钙超载，减少膜磷脂的分解，稳定细胞膜，从而起到保护细胞作用。

因此，我们推测丹参首先通过稳定VEC细胞膜和核膜、保护细胞膜结构的完整性、稳定细胞的形态、改善VEC功能、减少或抑制促纤维化细胞因子生成，增加细胞耐氧能力、改善OSF缺氧状态的作用，改善角朊细胞的营养，恢复上皮的机械屏障作用、减少外因的刺激；并通过调节细胞因子使胶原降解，在临床上出现治疗后粘膜变红、质地变软，疤痕消失。

3.3丹参对OSF微血管生成作用:在血管新生研究观察评价新生血管数目和侧支循环建立情况指标中，MVD能够反映血管新生强度的有效指标。CD34是特异的、敏感的新生血管内皮细胞标记物，有较强的重复性，优于内皮细胞其它标记物[8，9]。结果显示：OSF早期上皮内微血管减少，间质中微血管则明显扩张；中、晚期上皮内已无明显血管存在，间质、肌组织及腺体微血管数目明显减少或狭窄或闭塞。各期OSF治疗后新生微血管明显增加，MVD计数与正常对照组接近，与治疗前组比较，差异有统计学意义，显示丹参治疗后启动了血管新生的过程，经治疗后的大多数OSF病例，微血管数量明显增多，少数病例微血管数量增加不明显，但畸形血管减少，血管壁增厚，血管形态接近正常。新近研究表明[10，11]，内皮祖细胞（EPCS）在机体缺血、组织损伤、细胞因子或药物刺激下，可从骨髓向靶部位动员、分化、增殖，形成新生血管，因子在临床可能出现少数OSF患者未治疗便自愈的病例。用丹参治疗OSF，可能是通过诱导内皮祖细胞分化成为成熟的内皮细胞，参与损伤的微血管内皮细胞的修复和促进微血管的新生；或是通过稳定内皮细胞的结构，调节内皮细胞生长因子，诱导微血管新生，促进侧技循环的建立，改善局部血液循环障碍，降解并吸收胶原纤维而发挥治疗OSF的作用[12]。

3.4研究丹参治疗机制的意义:目前OSF尚无理想的治疗措施，而丹参等复方中药治疗因其副作用小已成为OSF治疗学的热点，探讨丹参治疗OSF的作用机制为临床推广使用获得理论依据，随着人们对OSF的不断了解，进一步为OSF的发病、诊断及综合治疗提供新的思路。

参考文献

[1]Lee TW,Chen GG,X H,et al.Differential expression of inducible nitric Oxide synthase and Peroxisome Proliefrator-active receptor gammia in non-small cell lung carcinoma.Eur J Caner,2003,139(9):1296-1301

[2]吴铨，刘彦仿。免疫组织化学病理[M]。北京：科学技术出版社，2007，10：5-54

[3]Niu XJ,Wang ZR,Wu SL,et al.Relationship between inducible nitric arcinoma tissue.orld J Gastroenterol.2004,10(5):725-728