基于MI—RI大鼠心肌细胞代谢组学研究四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制

材料

1.1 仪器

气相色谱-质谱联用仪（7890A GC-5975 MSD，Agilent）、CO2培养箱（Thermo Electron Corporation）；立式高压蒸汽高压灭菌器（MLS-3020，SANYO）；双人双面超净工作台（SW-CJ-2F）；通用离心机（Heraeus Megafuge 1.0R，Thermo）；酶标仪（PC plus 384）；透射电镜（H-600 IV Hitachi）；倒置显微镜（CK40，OLYMPUS）；氮气吹干仪（BF 2000- 15A）；微型旋涡混合器（WH-3）。

1.2 试药

DMEM 高糖培养基，0.25%胰蛋白酶溶液（HyClone）；胎牛血清FBS（兰州民海生物工程有限公司）；DMSO（成都科龙化工试剂厂）；MTT（Solarbio公司）；磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；链霉素（大连美罗制药厂）；青霉素（华北制药厂）；LDH，CK试剂盒（南京建成生物工程研究所）；乳酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、葡萄糖、果糖、甘露糖、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、棕榈酸、硬脂酸（上海安研商贸有限公司）；乙腈、甲醇（Fisher Chemicals 公司）；甲氧胺盐酸盐、MSTFA、正庚烷、TMCS、吡啶（Sigma-Aldrich 公司），实验用水均为超纯水（Milli-Q级），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 四逆汤和缺甘草四逆汤样品的制备^[8-9]

四逆汤样品：取生附片30 g、炙甘草30 g和干姜20 g，置于圆底烧瓶中，加8倍量水浸泡0.5 h，回流提取，武火煮沸后文火保持微沸1.5 h，提取液趁热用纱布滤过；提取3 次，合并水提液，减压浓缩至适量，加去离子水定容至100 mL。

缺甘草四逆汤样品：取生附片48 g和干姜32 g，其他操作同上，即得缺甘草四逆汤样品溶液100 mL。

2.2 硫代硫酸钠“缺血”液的配置

取化学缺氧剂Na2S2O3溶于PBS 中，按试验中要求配制成各浓度“缺血”液，混匀，经0.22 μm滤器滤过，避光，临用现配。

2.3 含药血清及细胞培养基的制备

SD大鼠，清洁级，体重（200± 20） g，雌雄各半，实验动物生产许可证编号SCXK（川）2008-24，试验前12 h禁食不禁水。随机分为3 组（正常组、四逆汤组、缺甘草四逆汤组），每组8 只。

四逆汤组：灌胃四逆汤（预先温热），给药量为20 μL·g-1体重，每天1次，连续7 d。缺甘草四逆汤：灌胃缺甘草四逆汤（预先温热），其他同四逆汤组。正常组：于第7 天灌胃等量的生理盐水。末次给药后0.5 h，眼眶后静脉丛取血，静置1 h，离心（4 500 r ·min-1，10 min），分离血清，-70 ℃冷冻保存。

取含药血清和空白血清，室温解冻，56 ℃水浴灭活30 min，用DMEM 配制细胞培养液（含血清10%），经0.22 μm滤器滤过，除菌，临用现配。

2.4 细胞培养

H9c2大鼠心肌细胞株 （ATCC，CRL-1446，武汉博士德生物技术公司） 于含10%FBS的DMEM完全培养基（含青霉素100 U·mL-1、链霉素100 U·mL-1）中培养（培养箱条件为37 ℃，5%CO2）。贴壁生长后，2～3 d传代1次，按 1∶4传代。状态良好的取对数生长期细胞进行试验。

2.5 心肌细胞接种、分组及MI-RI模型的制备

调大鼠心肌细胞H9c2密度为 8×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔接种200 μL；调细胞密度为5×104个/mL，接种于6 孔培养板，每孔接种2 mL。培养2～3 d，待细胞覆盖率达到80%～ 90%时进行试验。

心肌细胞MI-RI模型的制备：更换正常细胞培养液为等量的“缺血液”，置CO2培养箱中孵育2 h，造成细胞缺血。再将“缺血液”换为正常细胞培养液，孵育24 h，对细胞造成再灌注损伤。

考察四逆汤及缺甘草四逆汤对心肌细胞MI-RI造模后损伤的作用及细胞培养液的分析，取心肌细胞随机分为4组，每组6复孔。试验分组如下：正常对照组，常规培养，细胞培养过程中不予任何干预；MI-RI模型组，造模后，加含10%空白血清的培养基；四逆汤组，造模后，加含10%四逆汤组大鼠血清的培养基；缺甘草四逆汤组，造模后，加含10%缺甘草四逆汤组大鼠血清的培养基。

MTT 法检测各组细胞存活率及生化指标，结果见表1。收集各组细胞培养液于-20 ℃密封保存待测。

2.6 四逆汤（缺甘草与否）对MI-RI心肌细胞的作用

2.6.1 心肌细胞形态学观察 心肌细胞接种于6孔培养板中分别经过上述各组所述方法处理后，于倒置显微镜下观察心肌细胞的形态和生活状况，并拍摄显微照片。

实验结果显示，加不同浓度Na2S2O3的PBS溶液作用后，与正常对照组的心肌细胞相比，模型组心肌细胞体积均有变小，且随着浓度的增加，形态损伤也随之加重，并出现细胞脱落现象；作用时间越长细胞损伤程度越明显；1.5 mmol·L-1组，作用2 h的心肌细胞损伤更加严重。

空白对照组：心肌细胞生长旺盛，细胞结构清晰。MI-RI模型组：心肌细胞开始变得粗糙，形态显不规则，细胞间隙增大，开始有细胞脱落的现象出现。四逆汤组：细胞可明显抑制再灌注对心肌细胞的损伤，表现为细胞形态虽稍有变小但仍很规则，间隙仍保持紧密，悬浮细胞明显减少。缺甘草四逆汤组：与四逆汤组相似，但部分细胞仍有损伤，见图1。

2.6.2 心肌细胞存活率测定 采用MTT比色法检测（边缘孔用空白培养基填充为空白对照组）。接种于96 孔培养板中的各组心肌细胞，进行相应处理后，每孔加MTT 溶液（5 g·L-1）20 μL，于孵箱中孵育 4 h，小心移弃培养液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，混合均匀，用酶标仪测定各孔吸光度A（检测波长为490 nm），计算细胞存活率，见表1。细胞存活率=试验组平均吸光度A/对照组平均吸光度A×100%。

2.6.3 生化指标的测定 分别各组心肌细胞上清培养液，分别按照LDH和CK试剂盒说明书进行检测。采用MATLAB（R2009a，The Math Works，Inc.）统计函数对实验结果进行处理，采用t检验判定各组与正常对照组数据间差异，见表1。结果显示，与正常H9c2 心肌细胞比较，模型组和缺甘草四逆汤组的心肌细胞存活率显著下降（P<0.01），LDH及CK活性显著升高（P<0.01）；四逆汤组心肌细胞存活率和CK 活性明显升高（P<0.05），LDH 活性显著升高（P<0.01）。与模型组比较，四逆汤组的存活率显著升高（P<0.01），缺甘草四逆汤组存活率明显升高（P<0.05）；四逆汤组和缺甘草四逆汤组的LDH 活性、CK 活性均显著降低（P<0.01）。缺甘草四逆汤组与四逆汤组相比，心肌细胞存活率显著升高（P<0.01），2组的LDH 活性相接近，CK 活性有明显差异（P<0.05）。说明四逆汤组及缺甘草四逆汤组可有效保护MI-RI 模型对H9c2心肌细胞的损伤，且四逆汤组保护作用更加显著。

2.7 四逆汤（缺甘草与否）对MI-RI心肌细胞代谢组学研究

2.7.1 细胞培养液样品前处理方法 取细胞培养液样品于室温解冻，精密吸取100 μL，加甲醇800 μL，涡旋混合1 min；离心15 min（转速1.2×104 r ·min-1），取上层萃取液300 μL于氮气吹干设备中低温（30 ℃）吹干，残渣加75 μL甲氧胺吡啶溶液（甲氧胺浓度15 g·L-1），涡旋混合2 min，于70 ℃烘箱中肟化1 h；加75 μL衍生化试剂MSTFA（含1%TMCS）涡旋混合2 min，室温静置1 h；加1 mL 正庚烷（含内标白术内酯Ⅱ 0.032 8 g·L-1），涡旋混合 30 s；离心10 min（转速4.0×103 r·min-1），取上清 300 μL 至GC 进样瓶，即得。

2.7.2 GC-MS 分析条件 HP-5MS 毛细管柱（250 mm×30 m，0.25 μm，Angilent），载气为高纯氦气，流速1 mL·min-1；进样量1.0 μL，不分流进样；进样口260 ℃；离子源（EI）230 ℃；四极杆150 ℃；电离电压70 eV；He 扫气流量10 mL·min-1；扫描方式：全扫描模式，m/z 30～600。升温程序（初始温度70 ℃，保持4 min；以每分钟 6 ℃升温至115 ℃；再以每分钟 4 ℃升温至126 ℃；以每分钟 6 ℃升温至190 ℃；以每分钟 1 ℃升温至194 ℃，保持2 min；最后以每分钟 3 ℃升温至280 ℃）。

2.7.3 统计分析 实验所得GC-MS 图谱数据通过XCMS-online（http：//metlin.scripps.edu/download/）工具箱进行峰校正、峰对齐和峰积分等预处理后，采用Matlab软件对数据进行归一化处理，为避免误差，采用内标（白术内酯Ⅱ）作为参比。数据预处理后的3 个数据集（空白对照组A +模型组B、模型组B+四逆汤组C、模型组B+ 缺甘草四逆汤组D）分别导入多维分析软件（SIMCA-P 13.0，Sweden）中，进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），经模式识别与特征代谢物的提取，得到引起2组间差异的主要潜在代谢标志物所对应的保留时间和m/z ，经NIST 08 质谱库检索、AMDIS 鉴定、文献对照和标准品比对等方法，对潜在生物标志进行指认。对17 个潜在代谢标志物的相对含量，采用Minitab V15.0（State College，USA）软件进行One-Way ANOVA （置信区间95%）检验，见表2，图2。

17 个潜在代谢标志物中，四逆汤组与缺甘草四逆汤组的潜在代谢标志物有明显的区别，仅四逆汤组回调的潜在代谢标志物：尿素、甘氨酸、硬脂酸和未知成分2；仅缺甘草四逆汤组回调的潜在代谢标志物：亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和脯氨酸；二者共同回调的潜在代谢标志物：乳酸、未知成分1、缬氨酸、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、果糖、葡萄糖、甘露糖和棕榈酸。

3 结论与讨论

本研究采用体外心肌细胞试验，通过测定LDH与CK活性，二者是评价心肌缺血程度的客观指标，也是判断MI-RI心肌细胞不可逆的重要指标。结果表明四逆汤与缺甘草四逆汤对MI-RI 模型对H9c2心肌细胞造成的损伤均具有明显的保护作用，且前者保护作用更加显著。四逆汤对H9c2心肌细胞损伤的保护作用更强，一个重要原因是四逆汤能通过调节LDH，CK等指标的水平及减少MI-RI所致的心肌细胞的凋亡可挽救更多的心肌的作用，起到缓解心肌细胞坏死的发生，提高MI-RI 的治疗效果 [10]。

通过对代谢组学数据进行统计分析，17个潜在代谢标志物中，乳酸盐、果糖、葡萄糖、甘露糖和3-磷酸甘油与糖酵解途径相关，这表明四逆汤（缺甘草与否）对缺血再灌注损伤H9c2心肌细胞的保护作用是通过调节与糖酵解的途径来实现的。

MI-RI模型损伤，因为H9c2心肌细胞缺血缺氧使有氧代谢发生障碍，能量供应以糖酵解为主，通过糖酵解生成乳酸；同时，H9c2心肌细胞模型组的LDH 活性显著升高，也表明乳酸含量升高的必然性。这一点与之前心肌细胞损伤的病理生理变化的研究结果相吻合^[11]。葡萄糖和甘露糖含量显著降低是因为造模后的心肌细胞在缺血缺氧的环境下，完全通过糖酵解来获得能量所致^[12]；果糖的含量稍有升高，可能是在复氧的情况下，恢复葡萄糖的有氧代谢，使部分葡萄糖转化为果糖，而心肌细胞无法完成果糖的糖异生过程所致^[13]。MI-RI模型组中3-磷酸甘油的含量显著升高，可能因为在缺血缺氧条件下果糖与甘露糖等己糖转化为3-磷酸甘油酸所致^[12]。棕榈酸与硬脂酸2种不饱和脂肪酸的含量显著降低，可能因为在缺血缺氧条件下，葡萄糖的无氧酵解使葡萄糖仅在有氧氧化生成乙酰CoA的含量降低，从而致使以乙酰CoA为合成原料的棕榈酸与硬脂酸的含量显著下调^[12]。缬氨酸与异亮氨酸属支链氨基酸，作为心肌缺血时心脏可供选择的重要能量底物^[13]，心肌细胞在缺血缺氧情况下，利用支链氨基酸作为代偿性的能量供给，致使二者在MI-RI模型组中的含量显著降低。亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸和脯氨酸的含量水平显著降低，这些α-氨基酸作为能量代谢的重要前体及能转化为一些生物分子^[12]，其相对含量的变化可能与心肌细胞在MI-RI过程中对能量的需求而应激调节的结果。尿素的含量显著升高，可能与上述几种氨基酸的代谢使尿素的含量有所积蓄有关^[12]。

与MI-RI 模型组相比，四逆汤组和缺甘草四逆汤组除甘露糖外，分别将乳酸等12种代谢物的含量进行了不同程度的回调。从相对含量分析四逆汤组和缺甘草四逆汤组间的差异主要表现如下。

乳酸、谷氨酰胺与葡萄糖的含量在附子的3 种双酯型生物碱的毒性代谢组学分析结果^[14]是血浆中乳酸盐的水平升高，葡萄糖和谷氨酰胺的含量下降；缺甘草四逆汤组中乳酸和谷氨酰胺的回调幅度较四逆汤组回调的幅度明显减小，而葡萄糖的回调幅度则过大，甚至超过了空白对照组的含量水平。3 种双酯型生物碱分别对血浆中葡萄糖含量的影响有高有低不尽相同，本研究结果可能是由于四逆汤缺甘草方中复杂成分总体的调节作用使葡萄糖含量水平显著升高。以上均表明四逆汤中甘草解附子之毒通过调节糖酵解途径而实现的。

除乳酸、未知成分1、缬氨酸、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、果糖、葡萄糖和棕榈酸等代谢物的含量为四逆汤组与缺甘草四逆汤组共同回调外，前者回调了尿素、甘氨酸、硬脂酸和未知成分2的含量水平，后者回调了亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和脯氨酸的含量水平。根据以上潜在代谢标志物与生物代谢途径的关系可知，四逆汤中甘草解附子之毒是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中的氮的代谢途径得以实现的；缺甘草四逆汤组主要通过调节糖酵解、脂质代谢和α-氨基酸的代谢途径发挥保护MI-RI模型对心肌细胞的损伤，尤其是缬氨酸等α-氨基酸作为能量代谢的重要前体和能转化为一些生物分子，其含量变化可能因为缺甘草四逆汤中干姜与君药附子协同发挥辛热而助阳之功，或此应激使α-氨基酸的代谢重构以满足心肌细胞的能量需求有关。

未知成分1和未知成分2在各组中含量水平变化都较显著，但因前者在NIST08数据库中检索匹配度都很低，难以定性；后者保留时间靠后，与溶剂、保护气等杂质峰混在一起，亦难以对其进行定性识别。

综上所述，本研究采用基于GC-MS 技术的代谢组学方法研究了四逆汤（缺甘草与否）对体外MI-RI模型对H9c2 心肌细胞的保护作用，结果显示四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制是通过调节糖酵解、脂质代谢、三羧酸循环和氨基酸代谢中的氮的代谢等生物代谢途径实现解毒增效之功。为进一步阐释四逆汤中附子配伍甘草解毒增效机制，对在体血浆进行代谢组学技术结合血清化学指纹图谱研究还在进一步研究中。

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