抗菌肽AN5—2与大肠杆菌基因组DNA相互作用的光谱研究

材料与方法

1.1材料

抗菌肽AN5-2由青岛贝泰克生物科技有限公司合成，纯度95%；大肠杆菌标准株（Escherichia coli ATCC 25922）由本实验室保存。溴化乙啶（EB），Luria-Bertani（LB）培养基和Mueller-Hin-ton（MH）培养基购自北京鼎国生物公司。PBS缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购白天根生化科技（北京）有限公司。

1.2最低抑菌浓度MIC测定

采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽AN5-2的最低抑菌浓度（MIC）。将-80℃冰箱保存的大肠杆菌标准株涂布LB固体培养基平板，于37℃培养24h。挑取单克隆菌落接种MH液体培养基，37℃，180rpm过夜振荡培养。用MH培养基将过夜培养的菌液稀释到5×10⁵CFU/ml，按90gμl/孔加入到96孔板中；将抗菌肽AN5-2从1mg/ml开始倍比稀释后，按10>1/孔加入到菌液中；然后于37℃，180rpm，培养24h；测定OD590nm，计算最低抑菌浓度MIC。

1.3抗菌肽AN5-2与基因组DNA相互作用紫外光谱测定

取500μl浓度为50fig/mI的基因组DNA溶液加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液，抗菌肽溶液的浓度分别为10μg/ml、20μg/ml和40tμg/ml，37℃孵育30min后在岛津公司UV-2550紫外分光光度计上进行OD200nm-OD320nm波长扫描测定反应体系紫外光谱，等体积无菌水做为对照。

1.4抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合DNA的荧光光谱测定

取500μl浓度为500μg/ml的基因组DNA溶液（含1.5μg/ml溴化乙啶）加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液，37℃避光孵育10min。加入lml不同浓度的肽溶液，肽溶液的浓度分别为100>g/ml、200>g/ml和400/分μg/ml，37℃避光孵育30min。用岛津公司RF-5301 PC荧光分光光度计扫描反应液在OD550nm～OD750nm波长范围的荧光强度（激发波长）λexcitation=535nm），等体积无菌水做为对照。

1.5抗菌肽AN5-2-基因组与DNA相互作用圆二色光谱测定

将100μl浓度为0.5mg/ml的基因组DNA溶液加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液，抗菌肽溶液的浓度分别为100μg/ml、200μg/ml和400/μg/ml，混匀后使用日本分光株式会社JASCO-810圆二色光谱仪测定圆二色光谱。光谱扫描范围为OD220nm-OD320nm。等体积PBS缓冲液作为阴性对照。

2结果

2.1最低抑菌浓度MIC测定结果

微量肉汤稀释法测定抗菌肽AN5-2的最低抑菌浓度为10μg/ml。

2.2抗菌肽AN5-2与基因组DNA结合的紫外光谱

当抗菌肽AN5-2与大肠杆菌基因组DNA以嵌插的方式作用时，紫外光谱出现减色效应，减色效应与插入作用的强弱呈正相关；当DNA双螺旋结构破坏时则表现为增色效应。如图1所示，随着抗菌肽AN5-2浓度增加，基因组DNA的最大吸光值逐渐降低，说明抗菌肽可以与基因组DNA结合，由于抗菌肽AN5-2的插入引起DNA碱基对的分开导致DNA构象变化，但抗菌肽AN5-2未引起基因组DNA的断裂。

2.3抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合DNA的荧光光谱

溴化乙啶（EB）在为一种嵌入型荧光染料，其在水溶液中荧光很弱；但当它通过嵌入方式与双链DNA结合时，其荧光强度大幅度增强。如图2所示，实验结果表明EB-DNA复合体系的荧光强度随着抗菌肽AN5-2浓度的增加而不断降低，说明抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合大肠杆菌基因组DNA。

2.4抗菌肽AN5-2与基因组DNA相互作用圆二色光谱

在DNA的圆二色光谱中，270nm波长处的正峰是由碱基的堆积作用产生的。如图3所示，抗菌肽AN5-2与DNA相互作用后，正峰强度降低，说明抗菌肽ANS-2使DNA双螺旋结构变得松散，也削弱了DNA碱基对之间的π-π堆积作用。但DNA的圆二色光谱峰位未发生变化，说明抗菌肽AN5-2的加入只影响了基因组DNA二级结构，未引起双螺旋的解链。

3结论

在以往的抗菌肽作用机理研究中，人们较多关注抗菌肽与细菌细胞膜的相互作用，并提出了“桶板模型”，“地毯模型”，“虫孔模型”等多种相互作用模型。但抗菌肽与细菌的其他细胞器，如线粒体、胞内蛋白和细胞骨架等的相互作用报道较少，特别是与细菌基因组DNA作用的报道更是少见。见诸报道的有抗菌肽PR-39可以作用于革兰氏阴性菌的DNA，抑制DNA的转录及翻译。乳铁多肽Lfcin作用于细菌DNA后，引起细菌基因表达的改变。

抗菌肽对细菌的胞内损伤是通过抑制细胞膜蛋白质的合成，干扰细菌的生理代谢等途径实现的。研究发现基因组DNA是抗菌肽的重要作用靶点，抗菌肽可以干扰基因复制、抑制转录的蛋白质合成。实验结果表明抗菌肽AN5-2杀菌的作用靶点是基因组DNA。抗菌肽AN5-2能够诱导DNA结构变化，改变细菌DNA构象，双螺旋结构松散。基于实验结果，我们推断抗菌肽AN5-1首先通过静电作用和疏水作用与细菌细胞膜结合后进人细菌内部，与细菌基因组DNA通过静电作用吸引靠近，再通过疏水作用、氢键作用等非共价作用嵌插如DNA双螺旋碱基对形成的疏水区域，使DNA链解链引发DNA结构发生变化，从而影响DNA的正常生理功能和细胞周期。