核酸疫苗

摘 要 核酸疫苗自出现以来，就以高效、持久、广谱、简便、廉价、无致病性等特点，作为一种新型的疫苗而得到广泛的研究和应用。核酸疫苗不仅有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。在不久的将来，核酸疫苗有望成为人类防治疾病的重要手段。

关键词 核酸疫苗 抗原基因 免疫机制

中图分类号 Q-3文献标识码 E

20世纪90年代初，一系列关于注射外源基因在体内诱导免疫应答的报道揭开了核酸疫苗研究的序幕。由于核酸疫苗可以诱导机体产生全面的免疫应答，并且对不同亚型的病原体具有交叉防御作用，同时又具有安全、可靠、生产方便等优点，故被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核质粒表面载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动植物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。

1 核酸疫苗的构建

核酸疫苗的构建是通过重组DNA技术，将抗原基因定向插入哺乳动物细胞表达载体，转入宿主细胞后，筛选并获得重组克隆的过程，可以分为以下4个过程：抗原基因和载体的制备；抗原基因和载体的连接；重组DNA导入宿主细胞；重组分子的筛选与鉴定。

1.1 抗原基因和载体的制备

抗原基因只有在正确的方向，正确地读框插入载体中的启动子下游才能被表达。因此，在核酸疫苗的构建过程中必须保证抗原基因的定向插入或插入载体后鉴定抗原基因的方向。其中，抗原基因的定向插入是较为直接和有效的方法。要做到抗原基因的定向插入，必须是抗原基因两端分别带有各不相同的限制内切酶的黏性末端。而载体两端也需带有能与抗原基因两端分别互补配对的黏性末端；如抗原基因两端的限制酶位点与载体不符，可通过克隆载体更换限制酶位点或设计需要限制酶位点的PCR引物，做PCR来达到目的。

1.2 抗原基因和载体的连接

1.2.1 全同源粒性末端连接

DNA插入片断与载体用相同的内切酶切开，两者的两端具有相同的抗原基因和载体的连接黏性末端，这种连接称为全同源黏性末端连接。

1.2.2 定向克隆

使外源DNA片段定向插入到载体分子中的克隆方案称为定向克隆。定向克隆是用2个不同的限制性内切酶切割目的DNA分子，产生2个不同黏性末端来实现的。

1.2.3 平末端连接

有些限制性内切酶切割靶DNA的2条链不产生突出端（粒端）而产生平末端（平端）。平端之间的连接效率比粒端之间的连接效率变低，但因平端连接具有普适性，有时比较有用。例如，限制酶HaeⅢ产生的平端不仅能与HaeⅢ或其他限制酶产生的平端连接，而且能与补平或削平后的其他内切酶切割产生的3"-与5"-突出端连接。

1.3 重组DNA分子导入宿主细胞

在核酸疫苗构建过程中，操作的载体主要是质粒DNA。将质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程称为转化。而将质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入真核细胞的过程称为转染。

1.4 重组子的筛选与鉴定

重组子的筛选与鉴定可以在各个水平上进行，例如DNA水平、蛋白质水平及基因所能表现的功能水平。DNA水平有酶切、PCR初步鉴定、核酸杂交和DNA序列分析。蛋白质水平有插入失活双抗生素对照筛选和插入失活、Lacz’基因的蓝白斑筛选。

2 核酸疫苗的免疫

2.1 免疫的机制

质粒DNA被导入细胞后，得到抗原编码基因。即在质粒所带强启动子的作用下表达抗原基因蛋白，随后被降解成8～12个氨基酸的短肽，这些短肽含有不同的抗原表位。来源于胞液和囊液的抗原表位则分别与MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子结合，并被递至到细胞表面，与MHC-Ⅰ类分子结合的短肽激活CD8+T细胞（CTL）,与MHC-Ⅱ类结合的短肽则激活CD4+T细胞（T辅助细胞）。而分泌到细胞外的抗原则为带有抗体的B细胞捕捉，并在T辅助细胞分泌淋巴因子的刺激下转化为浆细胞，大量分泌抗体。

2.2 抗免疫接种的途径

抗原的表达是决定于被细胞摄取的DNA量以及抗原基因在被转染细胞中的表达水平和持续时间。被转染细胞的数量取决于核酸疫苗的剂量和剂型核细胞种类。同时，由于在某一点的DNA摄取剂量与该点的注射量并非成正比，因此，在考虑免疫接种的总剂量时还应将免疫剂量分数个点连续接种以增加摄取量。

目前，核酸疫苗的免疫接种途径有肌肉注射、基因枪介导的皮内或皮下导入、黏膜表面涂布、静脉注射和腹腔注射。其中肌肉注射是目前应用的最广泛且被证明是十分有效的免疫接种途径，静脉注射的保护效率也达83％。

3 核酸疫苗的特点

3.1 激发机体全面的免疫应答

其保守抗原的保护性免疫应答对不同亚型的病原体有交叉抵御作用,能联合免疫,即可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中或将不同抗原基因的多种质粒联合应用,制备多价核酸疫苗。

3.2 免疫效果好、免疫应答持久

核酸疫苗能在个体内长期存在并持续表达低水平的抗原蛋白，无须后续免疫注射而能够诱导持续的免疫效应达一年以上。与普通蛋白疫苗不同，核酸疫苗能在自身细胞中产生外源性蛋白，这种蛋白交织在原核生物表达系统中产生的蛋白质更像天然分子，其递生过程与自然感染十分相似。核酸疫苗表达的接近天然构象，抗原性强。因此，这样的免疫原将含有在构象上相关的表位，诱导产生对应于天然抗原的免疫应答。另外，核酸疫苗对已有免疫力的个体接种仍可起作用。

3.3 导致细胞毒T淋巴细胞激活而诱导细胞免疫

传统疫苗中只有活疫苗能诱导细胞免疫，但活疫苗存在着恢复感染的危险，尤其在免疫抑制或营养不良的个体中以及存在其他病毒感染的情况下。核酸疫苗与减毒活疫苗和载体活疫苗一样引起CTL应答，但却不存在后两者毒力回升的危险，也不存在散毒现象。

3.4 方法简便、价格低廉、便于储存和运输

核酸疫苗仅需要在细菌中生产，构建高效表达质粒，与普通疫苗相比，核酸疫苗的制作省去了抗原提取和纯化等繁琐耗时的过程，核酸疫苗用量少，干燥的DNA在室温下相对稳定，不需要冷藏设备，比其他疫苗更经济。

4 核酸疫苗的应用

医学科学迅速发展的今天，核酸疫苗可以克服所选用的抗原不能在宿主细胞中表达，而可以类似于病原微生物感染方式产生抗原，这种天然构系的抗生素原能按正常途径加工处理并提呈给免疫系统，从而激发免疫应答。目前，常用的核酸疫苗有乙型肝炎核酸疫苗、艾滋病核酸疫苗、流感病毒核酸疫苗、疟疾核酸疫苗、利什曼病核酸疫苗、猪带绦虫病核酸疫苗、肿瘤核酸疫苗等。

目前，核酸疫苗不仅用于感染性病原体的防治，并且在自身免疫性疾病等与免疫相关的疾病中也能发挥出重要作用。由于核酸疫苗引发TH2性免疫应答能对自身免疫性疾病防治产生深远的影响。研究人员做了用核酸疫苗预防实验室自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的尝试，并取得成功。因此，核酸疫苗在治疗TH1免疫反应介导的自身免疫性病，如多发性硬化、青少年型糖尿病和类风湿性关节炎等疾病，有广泛的应用前景。

5 核酸疫苗的潜在缺陷

5.1 核酸疫苗导入与致癌的可能性

核酸疫苗是介于生物治疗剂与基因治疗剂产品之间的疗法。外源基因导入后，有可能激活内源性原致癌基因，或者使宿主抗癌基因失活，这一可能性不容忽视。目前检查的1 800余种核酸疫苗中，虽然没有发现外源基因与宿主染色体整合的证据，但核酸疫苗真正应用于人体之前，这个问题必须加以解决，如果核酸疫苗DNA与宿主染色体发生整合，可能会发生难以预料的严重后果。

5.2 产生抗DNA抗体

目前对于抗DNA抗体的产生原因有2种观点：一是有B淋巴细胞增生而产生，二是抗原特异性选择引起B淋巴细胞活化而产生。

5.3 持续表达外源抗原可能产生不良后果

从理论上讲，外源抗原表达的时间越长，产生不良后果的可能性越大。可能产生的不良后果包括：产生耐受性、自动免疫、过敏反应、超免反应等。另外还有2个不容忽视的后果：一是持续低水平的表达的抗原可能会被血中的抗体清除，不能引起足够的免疫答应；二是持续高水平的表达外来抗原，可能引起机体超免反应，最终导致机体免疫抑制而易感染其他病原体。