卫气虚相关血浆代谢标志物的季节性变化研究

材料

1.1 动物

雄性SD大鼠80只，SPF级，6～8周龄，体质量（180±30）g，河北医科大学实验动物中心，动物合格证号1309031、1312049、1403037、1406027。饲养于光照周期12 h/12 h的环境中。

1.2 主要试剂与仪器

乙酸、乙酸铵均为色谱纯，Dikmapure（中国）公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，美国Fisher Scientific公司；蒸馏水，屈臣氏公司；其他试剂均为分析纯。高效液相色谱仪（ULTRIP-LC-100），美国AB公司；色谱柱，美国phenomenex公司，型号Hypersil Golda Q C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；高速台式冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司，型号TGL-16M；超低温保存箱，日本三洋公司，型号MDF-382E。

2 实验方法

2.1 造模和分组

大鼠适应性饲养1周后进行实验。通过疲劳加寒热交替法制造卫气虚大鼠模型[6]。将大鼠置于20 ℃水中游泳约30 min，常规条件饲养30 min后，放入恒温箱（40±1）℃中15 min进行热刺激，密切关注大鼠变化，每5 min观察1次，造成玄府开泄、卫表不固。大鼠取出后，常规条件饲养30 min，再放入-20 ℃冰箱10 min进行冷刺激，密切关注大鼠变化，每2 min观察1次。每只大鼠每日9：00疲劳加寒热刺激1次，连续7 d。大鼠症状表现：扎堆、蜷缩、发抖，被毛凌乱，汗出明显，出现鼻腔分泌物，活动减少，轻度腹泻等；血常规检查白细胞计数升高。符合以上表现为造模成功[7-8]。按随机数字法将大鼠分为春分实验组、对照组，夏至实验组、对照组，秋分实验组、对照组，冬至实验组、对照组，每组10只。对照组常规饲养，不做任何干预。

2.2 取样

大鼠分别于春分（2014-03-21）、夏至（2014-06-21）、秋分（2013-09-23）、冬至（2013-12-22）当日12：00取血，肝素钠抗凝，3500 r/min离心10 min，上清液移至冻存管-80 ℃保存。

2.3 血浆样本预处理

2.3.1 检测样品制备 乙腈、蒸馏水4 ℃过夜预冷。按乙腈/水（3∶1）混合液沉淀蛋白，混匀，14 000 r/min离心10 min；取上清液，按1∶1比例加入蒸馏水稀释，14 000 r/min离心10 min，移上清液入液相加样瓶中待测。

2.3.2 质量控制样本制备 各组血浆样品4 ℃复融，分别取10 μL血清，涡旋震荡混匀，按每管100 μL分装于EP管中，即为质量控制样本（QC），其余处理同检测样品处理方法。

2.4 HPLC-MS检测

应用ULTRIP LC-100和AB SCIEX Q-Triple 4500 System检测和采集数据。色谱条件：流动相A溶剂为水（0.05%乙酸，2 mmol乙酸铵溶液），B溶剂为乙腈（0.05%乙酸，2 mmol乙酸铵溶液）；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。质谱条件：采用正离子（ESI+）模式检测；质荷比（m/z）50～850 Da；Curtain Gas：30 psi；Gas1：55 psi；Gas2：55 psi；DP：60 V；EP：10 V；CE：5 eV；ISP：5500 V；Tem：500 ℃。

3 统计分析

3.1 数据预处理

利用Markerview1.2.1代谢组学分析软件将数据进行预处理，包括数据格式转换、导入；图谱查看、对比（TIC、2D、3D、MS）；去噪音；提取质谱峰；反卷积处理；峰排列、对齐、合并；列表去噪音；缝隙填补处理；数据导出获得二维数据阵。

3.2 数据分析

采用SIMCA13.0.3统计软件进行多变量分析，采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA），结合代谢组学分析软件Markerview1.2.1的t检验，分析标志性代谢物的组间差异。

3.3 差异性代谢物挖掘

利用PLS-DA模型变量因子（VIP值、阈值>1），结合t检验的P值（P<0.05）寻找差异性表达代谢物，在线检索数据库（http：//metlin.scripps.edu/）查找代谢物并推测其种类。

4 结果

4.1 代谢物分析

R2X是判别模型质量好坏的主要参数，它代表模型的解释率，一般其数值>0.4即表示该模型可靠。

4.1.1 春分大鼠血浆代谢物分析 在正离子模式下，共获得3个主成分。R2X：0.318；R2Y：0.997；Q2：0.861。PLS-DA得分图表明，两时间节点间差异显著，实验组与对照组完全被第一主成分分隔，表明当前PLS-DA模型可靠，可用于解释2组间的代谢差异并探索体现2组间差异的代谢标志物。结果见图1。

4.1.2 夏至大鼠血浆代谢物分析 在正离子模式下，共获得1个主成分，R2X：0.431；R2Y：0.807；Q2：0.775。PLS-DA得分图表明，两时间节点间差异显著，实验组与对照组完全被第二主成分分隔，表明当前PLS-DA模型可靠，可用于解释2组间的代谢差异，并探索体现2组间差异的代谢标志物。结果见图2。

4.1.3 秋分大鼠血浆代谢物分析 在正离子模式下，共获得2个主成分。R2X：0.316；R2Y：0.999；Q2：0.963。PLS-DA得分图表明，两时间节点间差异显著，实验组与对照组完全被第一主成分分隔，表明当前PLS-DA模型可靠，可用于解释2组间的代谢差异，并探索体现2组间差异的代谢标志物。结果见图3。

4.1.4 冬至大鼠血浆代谢物分析 在正离子模式下，共获得1个主成分。R2X：0.125；R2Y：0.935；Q2：0.698。PLS-DA得分图表明两时间节点间差异显著，实验组与对照组完全被第二主成分分隔，表明当前PLS-DA模型可靠，可用于解释2组间的代谢差异，并探索体现2组间差异的代谢标志物。结果见图4。

4.2 差异性代谢产物的挖掘及鉴定

经PLS-DA模型分析结合t检验筛选候选代谢物信息后，进行在线数据库检索，推测代谢物种类和生物学特征。经过初步比对，推测出胆红素、同型半胱氨酸、肌氨酸、二磷酸尿苷、睾酮、脑苷脂、半乳糖神经酰胺、胞嘧啶核苷8种差异代谢物为春季卫气虚可能标志物（见表1）；同型半胱氨酸、神经酰胺、睾酮、血管紧张素、肌氨酸、L-谷氨酰胺、N-乙酰天门冬氨酸、胆碱磷酸8种差异代谢物为夏季卫气虚区可能标志物（见表2）；维甲酸、同型半胱氨酸、环鸟甘酸、粪卟啉、甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（FMLP）5种差异代谢物为秋季卫气虚可能标志物（见表3）；富马酸二甲酯、胆固醇酯、神经酰胺、肌氨酸、环鸟甘酸5种差异代谢物为冬季卫气虚可能标志物（见表4）。同型半胱氨酸在春、夏、秋季实验组与对照组差异性比较中显著表达，神经酰胺在夏、冬季实验组与对照组差异性比较中显著表达，睾酮在春、夏季实验组与对照组差异性比较中显著表达，环鸟甘酸在秋、冬季实验组与对照组差异性比较中显著表达，肌氨酸在春、夏、冬季的实验组与对照组差异性比较中显著表达。

5 讨论

卫气虚是机体卫外不足，肌表失于固护，易于感受外邪的一种病机，容易导致表虚证。《内经》通过“天温日明，则人血淖泽而卫气浮，故血易泻，气易行；天寒日阴，则人血凝泣而卫气沉”指出卫气随季节变化的特征。以此推测以卫气生理功能失常为主要表现的卫气虚证也应该存在季节性变化特征。代谢组学描述的是生物体的内源性代谢小分子随时间变化而形成的代谢图谱，具有即时性和动态性特征。所以，代谢组学技术有助于客观认知卫气虚的生物学本质。若能确定卫气虚的生物标志物，则有助于进行辨证施治的疗效评价，并结合机体内源性生物标志物的轨迹变化，确定中药药效的物质基础。这也是“中医方证代谢组学”的观点[9]，通过代谢组学技术的利用，为中医辨证和疗效判定提供量化的客观依据。

本实验结果显示，同型半胱氨酸、富马酸二甲酯、睾酮、神经酰胺、胆固醇酯、环鸟甘酸、肌氨酸等物质在实验组和对照组间呈现明显差异，这些物质的功能涉及机体的脂代谢、氨基酸代谢、神经递质及激素水平的调节。同型半胱氨酸由肌肉、肝脏等组织蛋氨酸脱甲基生成，靠自身代谢的动态平衡调节浓度。当其浓度异常时可成为“毒性氨基酸”，导致甲硫氨酸循环发生紊乱，可使多个基因的甲基化状态发生改变，进而影响其表达[10-11]。肌氨酸又名N-甲基甘氨酸，由S-腺苷酶的一组甲基转移到甘氨酸后生成，是胆碱代谢成为甘氨酸过程中的一个非编码氨基酸中间体，存在于人体的肌肉和一些其他组织中，其生成过程中需要的甘氨酸-N-甲基转移酶主要表达在前列腺和其他组织[12]。肌氨酸转变成的甘氨酸是结构性氨基酸，是肌酸、嘌呤、谷胱甘肽等活细胞必需成分的代谢来源，在人体生理活动中具有重要作用。L-谷氨酰胺是人体肌肉中最丰富的游离氨基酸[13]，一方面能促进蛋白质的合成，参与保持谷胱甘肽储备，保护组织细胞避免受到氧自由基带来的损伤[14]，提高机体对应激的适应性；对于营养不良的个体，谷氨酰胺还通过提供能量ATP到巨噬细胞，调节巨噬细胞的分泌功能，也有认为谷氨酰胺能增强机体的体液免疫[15]。脑苷脂是广泛存在于生物细胞膜中的一类重要活性脂质，具有免疫调节、改善脂质代谢等多种生物活性[16-18]，其主要结构单元即糖基和神经酰胺，后者是细胞膜的重要组成成分，是神经鞘脂类的骨架结构。同时，神经酰胺可以作为第二信使，参与膜的信号传导[19]，在细胞的分化、增殖、衰老和凋亡过程中发挥良性调节作用[20-21]。N-乙酰天门冬氨酸存在于机体的正常神经元内，普遍存在于神经细胞胞体和神经轴突中，发挥营养神经的功能，并沿轴索传递信号[22]。睾酮的分泌主要受下丘脑-腺垂体-性腺轴调节，同时可以将信息反馈至调节轴，形成循环以维持体内性激素分泌的平衡。睾酮能够增加骨骼肌细胞膜对氨基酸的摄取、促进核酸、肌蛋白、红细胞和磷酸肌酸的生成，与机体的体质和运动能力密切相关。

在春、夏、秋、冬季节差异性表达的代谢物中，同型半胱氨酸、肌氨酸、神经酰胺、睾酮、环鸟甘酸分别在2个以上不同季节的实验组与对照组比较中发挥作用，尤其是同型半胱氨酸和肌氨酸分别在3个季节的实验组和对照组差异性比较中发挥作用，其对卫气和卫气的生理功能影响几乎持续四季，说明卫气虚的季节性变化与氨基酸代谢关系尤为密切，这也与本课题组前期研究中反复上呼吸道感染肺卫气虚证的潜在标志物多为氨基酸类的研究结果一致[23]。

综上所述，卫气虚的病理状况涉及机体氨基酸、脂类、神经递质、激素4个层面的代谢标志物变化。我们推测机体卫外功能的异常，即卫气虚状况的出现，与机体氨基酸、脂类代谢有关，也和机体神经调节以及激素调节密切相关，从代谢组学角度分析机体内源性生物标志物的细微变化，可以在早期通过量化指标确定卫气虚证，从而达到未病先防或既病防变的目的。

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（收稿日期：2016-07-05）

（修回日期：2016-08-05；编辑：华强）