猪苓糖肽的ＨＰＣＥ指纹图谱分析

摘要：采用毛细管电泳法（HPCE）建立猪苓糖肽的指纹图谱，HPCE工作条件为：采用电解质溶液50 mmol/L硼砂缓冲溶液（pH=10.0），毛细管熔融石英毛细管柱（75 μm×75 cm,有效长度为66.5 cm），电压20 kV，温度25 ℃，波长200 nm。猪苓糖肽的HPCE图谱有8个共有峰。该法具有较好的分离效果，可为猪苓糖肽的质量控制提供有效手段。

关键词：猪苓糖肽；HPCE；指纹图谱

中图分类号：S567.390.1文献标识码：A

猪苓为多孔菌科真菌猪苓（Polyporus umbellatus (pers.) Fries）的干燥菌核，具有利水消肿，渗湿的功效。猪苓糖肽［1］是猪苓菌丝体中的一种糖蛋白，能明显提高动物单核—巨噬细胞功能、NK细胞活性、体液免疫与细胞免疫水平，临床上可用于放化疗病人的升白等。HPCE［2］（highperformance capillary electrophoresis）是近年来迅速发展的一种新型分离分析技术，具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，特别适合于蛋白质、核酸、多肽、糖蛋白等生物大分子的分析。

本实验采用HPCE对猪苓糖肽进行分析，建立了迁移时间—峰高—峰面积的指纹图谱［3］，为猪苓糖肽质量控制建立了基础。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器

HP3D全自动毛细管电泳仪，包括DAD检测器、 HP化学工作站。熔融石英毛细管柱（75 μm×75 cm,有效长度为66.5 cm）。

1.1.2试剂

氢氧化钠、硼砂和磷酸二氢钠均为分析纯。

1.1.3培养基

蛋白胨2.0%；蔗糖 4.0%；酵母膏0.2%；K2PO40.3%；硫酸镁0.15%；维生素b10.001%； CaCl2 0.006%； ZnSO4 0.00004%； MnSO4 0.00005%； FeSO40.00001%。

1.2样品的制备

1.2.1猪苓菌丝体的制备

10000 L的发酵罐加入7000 L的培养基，25 ℃，100 r/min培养37 h后，板框过滤得到猪苓的菌丝体，80 ℃烘干，打粉机粉碎，得到猪苓菌丝体粉。

1.2.2猪苓糖肽的制备

猪苓菌丝体粉用10倍水量99 ℃提取两遍，4000 r/min离心，上清超滤（超滤膜的分子量是10000），截流液喷雾干燥，得到猪苓糖肽粉。

1.2.3电泳样品制备

称取9批猪苓糖肽粉各1.0 g，加20 mL蒸馏水,超声30 min，于4000 r/min离心20 min，取上清液，0.45 μm滤膜过滤，滤液作为供试电泳样品。

1.3电泳条件

背景电解质溶液A为50 mmol/L硼砂缓冲液（分别在pH = 8.5，pH = 10.0，pH =11.2时进样），样品用50 mbar进样8 S,操作电压20 kV，温度25 ℃，DAD全波长扫描。

背景电解质溶液B为50 mmol/L磷酸盐缓冲液（分别在pH =2.5，pH =4.0时进样），样品用50 mbar进样8 S,操作电压20 kV，温度25 ℃，DAD全波长扫描。

2 结果与分析

2.1共有峰的标定

根据9批样品HPCE图谱出峰时间、峰形和峰高等各项参数进行分析比较，得出8个共有峰（图1），选用保留时间为16.2 min的色谱峰作为参照峰，分别计算9批样品中共有峰的相对迁移时间平均值，猪苓糖肽毛细管电泳指纹图谱中1-8号共有峰相对迁移时间依次为0.571，0.628，0.971，1.00，1.07，1.42，1.45，1.90（表1）。

2.2共有峰的峰高比

比较各批样品的色谱图可知，选用迁移时间在16 min左右的色谱峰作为参照较好。（参照峰用s标示）不同的峰高比见表1。

2.3相似度评价

通过对9批不同的猪苓糖肽的电泳图谱分析（表2），各批猪苓糖肽样品相对于4号样品的相似度都在0.93以上（表3），表明各批猪苓糖肽样品所含成分基本一致。

3 分析与讨论

3.1电泳条件的优化

3.1.1缓冲液种类对猪苓糖肽电泳图谱的影响

将猪苓糖肽在电泳条件50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH = 2.5，pH = 4.0）下不出峰。可能是在低pH条件下，所有溶质都带正电，电渗流很低，因而迁移速度也相应减慢，同时也会造成溶质间荷质比差异减小而不出峰。在电泳时，采用50 mmol/L硼砂缓冲液时，样品在pH = 8.5、pH = 10.0和 pH = 11.2都出峰，这是因为采用硼砂作缓冲液，糖部分与硼砂形成络合物，吸收增加，还可以增加糖类的电迁移能力和对立体差异糖的分离能力。在蛋白质、多肽分析中，毛细管内壁硅羟基离解形成的带负电的吸附点与蛋白质、多肽分子中带正电基团之间的静电引力导致蛋白质、多肽分子吸附在毛细管内壁，但采用高pH值的硼砂缓冲液分离蛋白质，并在每次分析后用1 mol/L氢氧化钠溶液冲洗毛细管，可提高分离的重现性。从电泳图谱的出峰时间、峰形、峰高、峰面积和分离度等参数可知，硼砂缓冲液pH = 10.0时较好。

3.1.2不同硼砂缓冲液（pH=10.0）浓度对猪苓糖肽电泳图谱的影响

选用20 mmol/L、 50 mmol/L和70 mmol/L的硼砂缓冲液进行测定，结果表明，电解质浓度对样品的电泳图谱和特征有较大影响。随着电解质浓度增大，保留时间相应增大，三种不同浓度条件的峰形虽相同，但从分离度等情况来看，50 mmol/L和70 mmol/L 浓度条件优于20 mmol/L浓度条件。由于70 mmol/L浓度条件下出现杂质峰，且干扰检测峰，故确定最佳电泳条件为50 mmol/L硼砂缓冲溶液（pH=10.0）。

3.2HPCE指纹谱的分析与讨论

从指纹谱的结果来看，各批样品HPCE图谱中相对应色谱峰的峰高及保留时间的均值和标准偏差不是很理想，偏差较大，究其原因，可能是进样时电流、温度等微小差异造成的。当选用4（s）峰作为内标求出各色谱峰的相对保留时间和相对峰高时，偏差则大大减少，尤其是相对保留时间，偏差范围最大为±0.036，该结果可作为猪苓糖肽的质量控制指标。

参考文献

[1] 李太元，田广燕，许广波，等.猪苓菌丝体多糖对小鼠免疫水平的影响［J］.中国兽医学报，2007，27(1)：88-94.

［2］ 孔 毅.高效毛细管电泳及其在蛋白质,多肽分析中的应用［J］.药学进展，2000,10(4):204-208.

［3］ 袁 萍.云芝糖肽的HPCE分析方法的建立［J］.中成药，2002，24（9）：698-700.

唐庆九

Analysis of Polyporus umbellatus Glucopeptides Using

Highperformance Capillary ElectrophoresisFingerprint

Spectra (HPCEFPS)

XU Yanjuan QIAN Yanjuan JIANG Xiaofeng GONG Shengping

Highperformance capillary electrophoresis (HPCE) using a fused quartz capillary column was employed for fingerprint spectrum analysis of Polyporus umbellatus glucopeptide. Eight peaks were found to be constant in all nine glucopeptide samples tested. The technique represents a practical method for separating and identifying P. umbellatus glucopeptide, and our data provide the basis for effective quality control of glucopeptide material from this fungus.

Polyporus umbellatus glucopeptide;HPCE;Fingerprint spectrum