水热法制备磁性微球及其在植物基因组DNA提取分离中的应用

材料的制备及其相关生物技术产品开发利用受到国内外学者的广泛关注[5]。磁性纳米粒子因具有高比表面积、高饱和磁化强度和高生物相容性等优势而被应用于核酸提取、蛋白质纯化、酶的固定化、免疫学检测及磁导靶向给药等生物医学领域[6-8]。基于磁性微球的核酸提取分离法，近年来已被应用于各种疫病快速PCR检测、法医鉴定等领域[9]。

笔者采用高盐缓冲体系中磁性纳米微球结合核酸，利用低盐缓冲液洗脱的原理，建立了一种基于Fe3O4磁性纳米微球为载体的植物全基因组提取方法，该方法省去了多次的温浴、抽提、离心等步骤，节约了大量时间，旨在为全自动化、规模化提取核酸提供了理论和实践基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料。

盐芥、旱麦草、费尔猪毛菜、乌拉尔甘草、棉花、小麦新冬20、紫花苜蓿等植物材料均由石河子大学生命科学学院植物分子生物学实验室提供。

1.1.2药品试剂。

FeCl3·6H2O、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、盐酸胍、琼脂糖均为分析纯，购于Aldrich公司；乙二醇、醋酸钠、聚乙二醇（PEG-8000、PEG-2000）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氯化钠、氢氧化钠、盐酸等均为国产分析纯；

植物组织DNA提取所用裂解液、植物清洗液、结合缓冲液、洗脱液等均为新鲜配制。

1.1.3仪器设备。

水热合成反应釜（50 mL）购于河南巩义予华仪器有限公司；磁力搅拌器、悬臂式搅拌器均购于IKA集团；超声波清洗机（KQ-100E）购于昆山市超声仪器有限公司；真空干燥箱（DZF-6020）购于上海一恒科学仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪（AVATAR 360FT-IR）购于美国尼高力仪器公司；振动样品磁强计7307（VSM）购于美国Lake Shore公司产品；水平电泳槽购于北京六一仪器厂。

1.2方法

1.2.1水热法制备Fe3O4纳米粒。

将40 mL乙二醇加入50 mL 反应釜的聚四氟乙烯内衬中，准确称取1.35 g FeCl3·6H2O（5 mmol，98%）加入到40 mL乙二醇中，电磁搅拌20 min，使之完全溶解形成溶液；继续向其中加入3.6 g醋酸钠 和1.1 g PEG2000，将混合液继续剧烈搅拌30 min，然后将其置于超声清洗仪中，超声10 min，再离心5 min；如此反复3次，直至溶液充分溶解混匀。然后将水热反应釜封闭拧紧后置于预先加热到200 ℃的电热鼓风干燥箱中，并继续保持200 ℃，反应11 h；待反应完毕后关闭电热鼓风干燥箱电源，继续将水热合成反应釜置于其中，自然冷却至室温。

1.2.2Fe3O4纳米粒的清洗与浓度测定。

Fe3O4纳米粒的清洗：将反应产物转移至一干净的烧杯中，加入约30 mL无水乙醇，用玻璃棒搅拌均匀，置于5 000 T的磁铁上磁性分离10 min左右，之后弃掉上悬液。再加入约30 mL无水乙醇，置于超声波清洗机上超声清洗10 min，之后放置在磁铁上磁性分离。重复以上清洗步骤4次，直至上悬液清亮。再用去离子水清洗磁粒3 次，将所得的产物用11 mL去离子水重新分散后保存。

磁性纳米微球浓度的测定：取一个清洗干净的小烧杯，在烘箱中烘干8 h，放入干燥器中冷却至室温，称重W1。量取1 mL Fe3O4纳米粒加入到小烧杯中，烘干8 h，称重W2，由以下公式可得到磁性纳米微球的浓度。

磁性纳米微球的浓度（g/mL）=（W2-W1）/mL

1.2.3Fe3O4 磁性微粒的表征。

利用透射电子显微镜观察Fe3O4磁性纳米微球形貌并测试粒径大小及分散状态；同时用扫描电子显微镜（SEM）表征：观察Fe3O4磁性纳米微球的大小、表面特征及形貌。Fe3O4磁性纳米微球粒径大小及其粒径分布用马尔文公司的激光粒度散射仪（DLS）进行表征测定。Fe3O4磁性纳米微球的磁学性质（磁滞回线、矫顽力等）用振动磁强计（VSM）进行表征测定。

1.2.4植物叶片基因组DNA提取分离工艺。

将水热法制备的Fe3O4磁性纳米微球涡旋混匀，用移液器移取100 μL于2 mL离心管中，磁性分离1 min，弃上清。 从磁性分离器上取出离心管，在Fe3O4磁性纳米微球中加入350 μL结合液，吹吸混匀，待用。植物叶片组织样品处理：称取300 mg植物组织，置于研钵中，加入液氮研磨至细粉状，在组织解冻前向研钵中加入1.8 mL裂解液，研磨混匀，各吸取600 μL于2个新的2 mL离心管中，然后放于65 ℃ 水浴 25 min（期间每隔5 min颠倒离心管1次）。向离心管中加入5 μL RNase A，充分混匀，于37 ℃水浴 5 min后取出。 向离心管中加入1.2 mL氯仿，轻轻摇动2 min，随后12 000 r/min离心5 min。取上清约350 μL加入到已处理好的Fe3O4磁性纳米微球中，移液器吹打混匀，室温静置 5 min。再将离心管置于磁性分离器上分离 3～5 min，弃去上清。向管中加入 400 μL 清洗液，移液器吹打混匀，磁性分离，去上清。向管中加入 400 μL清洗液，移液器吹打混匀，磁性分离，去上清。将管盖打开，室温晾干 5 min。 向管中加入 100 μL 洗脱液，移液器吹打混匀，于 60 ℃ 水浴 5 min。 磁性分离直至上清澄清，上清即为纯化的植物组织基因组 DNA，将上清转移至另一离心管中，可直接用于后续试验或于-20 ℃低温保存。

1.2.5不同浓度Fe3O4磁性纳米微球对提取结果的影响。

将水热法制备的Fe3O4磁性纳米微球稀释成4个浓度：13、26、30、39 mg/mL，分别应用于小麦叶片DNA分离提取，通过紫外-可见光谱鉴定。

1.2.6DNA完整性的测定。

经纯化后的植物组织基因组DNA通过0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。

1.2.7DNA纯度、浓度的测定。

将纯化后的植物组织基因组DNA吸取5 μL在超微量分光光度计（nanodrop核酸蛋白分析仪）的测试孔上，打开操作系统，即可测定其浓度c（ng/μL）和纯度（OD260/OD280）。 其中DNA含量的计算：每100 mg植物组织能够提取的DNA的量（μg）=c×100（μL）÷1 000（μg/ng）。

2结果与分析

2.1Fe3O4磁性纳米微球制备和表征结果

经过水热法制备的材料经过清洗呈典型的Fe3O4磁性纳米材料的黑色悬液，在室温下能够长久保持胶体状态而不会发生絮凝沉淀（图1a）。当外加5000 T磁场时，制备的磁性微球会在20 s内全部移至外加磁场一侧，上清液呈清亮无色无残留杂质（图1b）。说明用上述方法制备的Fe3O4磁性纳米微球具有较好的分散性，而在外界磁场作用下又具有很强的磁响应性。

由图2a可知，产物的衍射特征峰分别对应晶体的（220），（311），（400），（422），（511）和（440）晶面，与具有尖晶石型结构的Fe3O4标准谱图JCPDS 标准卡片（JCPDS no.85-1436）完全吻合，XRD 数据中未检测到其他杂相的衍射峰，可以断定所得样品为单一相的纯Fe3O4。由图2b可知，样品在外加磁场达到饱和时的磁化强度为62.6 emu/g，表现出强的铁磁性。由图2d可知，所制备的Fe3O4磁性纳米微球呈单分散状态，粒径均一，将制备的Fe3O4磁性纳米微球用激光粒度仪进行表征分析（图2c），结果表明，其粒径主要分布在200～600 nm，其中，300 nm粒径的Fe3O4磁性纳米微球所占比例最高。

2.2Fe3O4磁性纳米微球提取植物基因组DNA的效果由表1可知，当磁性微球浓度为13、26、30、39 mg/mL时，提取量分别为18.2、25.3、 29.6和32.0 μg，纯度分别为1.95、188、1.82和1.64，说明所用Fe3O4磁性纳米微球浓度越高，所提取的核酸产量越高，但提取产物中蛋白等杂质较高，DNA纯度越低。经过多次试验优化选择，确定用30 mg/mL的磁性纳米微球作为提取植物叶片的载体浓度。

将该方法所制备的Fe3O4磁性纳米微球应用于盐芥、小拟南芥、旱麦草、费尔猪毛菜、乌拉尔甘草、棉花、小麦新冬20、紫花苜蓿叶片组织全基因组DNA的提取。提取的DNA经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，DNA条带单一、清晰、DNA完整性好，无降解产生（图3）。经NanoDrop 2000c Spectrophotometer（表2）检测其DNA的量和纯度，结果显示，其得率较高，OD260/OD280在1.78～1.93，说明纯度较高。

以盐芥的根、茎、叶片以及籽粒为材料，以水热法合成的磁性微球为提取载体，进行DNA的提取分离，结果表明，经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，提取的DNA条带清晰均一、完整性好，无降解产生（图4）。经NanoDrop 2000c Spectrophotometer检测其DNA的量和纯度，结果显示，OD260/OD280在164～1.94，说明提取的DNA中杂质较少，纯度较高（表3）。

3结论与讨论

近年来，水热法合成纳米微球成为关注的焦点，该方式操作简单，合成的磁性微球粒径均一，呈单分散性，饱和磁化强度高，更重要的是合成产率高，批间差小，这些优势有利于产业化生产[10-13]。该研究发现，聚乙二醇的分子量如PEG2 000、PEG6 000、PEG8 000、PEG10 000对制备的Fe3O4磁性纳米微球形貌、磁场中的磁响应性具有重要影响，PEG分子量的增大能获得粒径较小的磁性微球，但分散稳定性较差，在缓冲液中易发生团聚沉淀，对后续的应用造成困难。该研究中NaAc的用量、乙二醇的量、反应时间、反应温度（超过或者低于200 ℃）都会对Fe3O4磁性纳米微球的粒径、形状、磁响应性产生影响[6，11，14]。经过优化选择，1.35 g FeCl3·6H2O配比40 mL乙二醇，使用3.6 g醋酸钠作为还原剂、1.1 g PEG2000作为表面活性剂制备的Fe3O4磁性纳米微球在5 000 T磁场下具有较好的磁响应性。

该研究运用水热合成反应法制备的Fe3O4磁性纳米微球，形貌呈球形、粒径大小一致，分散性好，在3 000 T的磁性分离架上，30 s能够快速分离，而且具有超顺磁性，撤去磁场后能够重新恢复到分散状态，是用于核酸分离的理想材料。将所制备的不同浓度的Fe3O4磁性纳米微球用于新疆特色植物及其植物不同部位全基因组核酸的提取，均能够得到高产量和高纯度的DNA；该试验得到的提取所需的最适浓度为9.75 mg/mL。另外，与目前实验室通用的CTAB法相比，应用Fe3O4磁性纳米微球来提取核酸，方法简便，耗时少，无需反复大量离心，避免多次离心过程产生的剪切力对核酸的破坏，提取的核酸产量大、纯度高，可用于后续试验如PCR、酶切、全基因组分析等。

制备Fe3O4磁性纳米粒提取植物组织基因组DNA具有简单、快速（仅需要40 min左右）、无需离心机，凭借一个简单的磁性分离架即可完成，非常适合快速、野外、仪器设备欠缺的环境提取。然而，不同地区植物组织成分的种类、含量都会对植物基因组DNA的提取造成很大影响。因此，在提取过程中，植物组织裂解液的加入量，提取液的成分，需要根据不同植物特点和组织进行调整才能提取到完整、纯度高的基因组DNA。

与传统方法相比，该方法是一种方便、快捷且有较强通用性的基因组DNA提取方法，根据样本的不同，整个提取过程可在30～40 min内完成。研究发现，Fe3O4磁性纳米微球浓度越高，所提取的核酸产量越高，但纯度越低；30 mg/mL磁性微球浓度能够较好地保证核酸产量和纯度。

综上所述，该研究通过水热法制备了一种粒径均一、分散性好、饱和磁化强度高的Fe3O4磁性纳米粒，以此为载体建立了一种快速、简便提取植物DNA的方法，并选取新疆一些特色植物为样本进行DNA提取。整个提取过程省去了多次的水浴、抽提、离心等步骤。该研究结果显示，该方法提取的基因组DNA质量较好，可以满足PCR等下游试验。纯化得到的DNA 可用于酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等试验。该研究不仅限于对植物叶片基因组进行提取，如果更改裂解液和提取液成分还可将磁性微球应用于动物组织、真菌、细菌、病毒、质粒基因组的提取。

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