4株纤维酶产生菌的筛选及其酶活力测定

打开文本图片集

摘要：从大连龙湖湿地公园土壤中分离获得了经刚果红染剂染色后产生明显透明圈的4株真菌，经形态学鉴定分别是枝孢霉属（Cladosporium sp.）、镰孢属（Fusarium sp.）、漆斑霉属（Myrothecium sp.）和青霉属（Penicillium sp.），其中镰孢属产生透明圈相对直径最大为1.63 cm，枝孢霉属形成透明圈次之为1.60cm。通过酶活力测定比较：枝孢霉属的纤维素降解酶活力最高2.09IU/mL，镰孢属次之1.39 IU/mL。两种真菌降解纤维素形成的透明圈大小与酶活力呈负相关。

关键词：纤维素降解;酶活力;真菌

中图分类号：Q814

文献标识码：A

文章编号：1674-9944（ 2019） 24-0215-03

1 引言

随着社会经济的发展，能源短缺已经成为世界各国关注的热点问题，新的可开发的再生资源亟待我们去探索、研究。纤维素是自然界中广泛存在的一类碳水化合物和可再生的生物资源[1]，其结构中含有大量高能氢键，具有降解难、水解难的特点，自然界中只有10%左右的纤维素被人类利用，绝大部分天然纤维素在自然坏境中被微生物分解转化[2]。由于很多微生物可以产生促进纤维素降解的各种酶类[3，4]，从不同环境下分离得到的各类真菌、细菌等微生物中不乏具有较好纤维素降解能力的菌株[5-7]。本文从湿地土壤中分离获得4株具有纤维素降解能力的真菌菌株，并对其酶活力进行测定，为这些菌株的进一步开发利用和菌株发酵研究提供理论研究基础。

2 材料与方法

2.1 供试材料

土壤样品于2018年5月采自大连龙湖湿地公园，分别从水库湿地、草甸湿地、滨海湿地3种不同类型的土壤中，各采集多份土壤样品存放无菌试管中，带回实验室后立即进行样本的分离培养。

2.2 供试培养基

孟加拉红培养基（MEA）：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2P041 g，MgS04.7H20 0.5g，琼脂20g，1/3000孟加拉红溶液100 mL。马铃薯葡萄糖琼脂培養基：PDA培养基粉。纤维素一钠培养基：1000 mL去离子水，Na2HPO42.5g，KH2PO41.5g，蛋白胨2.5g，CMC-Na 20g，琼脂20 g，pH值调节至7.0～7.5。液体发酵培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，1000 mL去离子水。

2.3 主要试剂

刚果红溶液：按照1g药品加1000 mL水的比例配制刚果红溶液。NaCI溶液：在1000 ml_去离子水中加入58.5 g NaCI搅拌溶解，配制浓度为1 mol/L。DNS试剂：配置方法见魏群[8]。醋酸一醋酸钠缓冲液：称取乙酸钠10. 52 g溶解在450 mL蒸馏水中，用冰醋酸将溶液pH值调至4.8左右，最后定容至500 mL。葡萄糖标准溶液：称取100 mg的干燥葡萄糖溶于50 mL蒸馏水中，再定容至100 mL，配制成浓度为1 g/L。

2.4 试验方法

2.4.1 具有纤维素降解能力真菌的分离

称取10g湿地土壤装入有90 mL无菌水的三角瓶中，震荡摇匀样品lO min成土壤悬浮液后在21℃恒温摇床中150 r/min震荡1h，使土壤中的微生物均匀分散。移液枪吸取1 mL菌悬液至装有9 mL无菌水的试管中，依次稀释至10^-4浓度，吸取1 mL 10^-4浓度的菌悬液于MEA培养基上涂匀，25℃恒温培养箱中培养5～10 d。将MEA培养基中培养出真菌移植到PDA培养基上纯化培养。如有杂菌则多次进行纯化。

2.4.2 纤维素降解菌的初筛

把PDA培养基中培养7 d的菌落用直径为5 mm的打孔器打孔，将菌苔接种至CMC- Na培养基中25℃培养5～7 d，待菌落直径生长到约2 cm时，将配制好的刚果红溶液倒人培养基中，液体没过培养基约1 cm，反应15 min左右沥干培养基加入NaCI溶液，15 min后倒去NaCI溶液，观察是否有透明圈形成并记录透明圈直径。

2.4.3 纤维素降解菌的纤维素酶活力测定

将刚果红染色出现透明圈的菌株接种到液体发酵培养基中，25℃下200 r/min条件下恒温摇床培养箱中培养7d。取发酵液lOmL于离心管中，在3000 r/min、4℃低温离心机中离心15 min得到粗酶液，4℃储存备用。

在玻璃试管中加入1 ml_羧甲基纤维素一钠溶液，2 mL醋酸一醋酸钠缓冲液，每支试管中分别加入1 mL上述粗酶液，45℃水浴30 min。混合液冷却至常温时加入2 mL DNS试剂，沸水浴5 min，取出冷却至常温，用蒸馏水定容体系至25 mL，测定溶液在540 mm处的OD值。设置对照组：将粗酶液沸水浴10 min灭活后再加入，其他溶液与实验组一致，并一同操作。

绘制葡萄糖标准曲线：取15个玻璃试管，每个试管中分别加入O、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.O、1.1、1.2、1.3、1.4 mL的葡萄糖标准溶液，加入醋酸一醋酸钠缓冲液定容至5 mL，再分别加入2 mLDNS试剂，沸水浴10 min，冷却至常温，用蒸馏水定容至25 mL，测定溶液在540 mm处的OD值。以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线，给出回归方程。

定义酶活单位为单位时间内，使得纤维素水解生成1μg葡萄糖的酶液量。酶活力（IU/mL）=（葡萄糖含量（mg）×稀释倍数×5.56）/（反应液中加入的酶液量（ml）×时间（min））。

将试验组测得的每个菌株的OD平均值代入葡萄糖标准曲线的回归方程中，算出葡萄糖含量，再根据公式算出酶活力。

2.4.4 菌株形态鉴定

观察真菌菌落培养特征，刮取少量菌丝制片，显微镜下观察孢子形态、产孢结构等确定菌株的生物学分类地位。

3 结果与分析

3.1 纤维素降真菌的初筛结果

纤维素是CMC- Na培养基中唯一的碳来源，刚果红与纤维素化学反应出现深红色复合物，纤维素酶水解物葡萄糖周围则出现透明圈。透明圈大可以初步鉴定出菌株降解纤维素的能力强。

试验中共筛选出30株真菌菌落，其中刚果红染色后呈现透明圈的菌株有4株，如图1所示。通过测量菌落直径、透明圈直径等数据得出粗略结果，如表1所示，14号菌株的透明圈最大，其次是11号，15号和29形成透明圈较小。

3.2 纤维素降解酶活力测定

3.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

试验以葡萄糖含量为横坐标，540 nm下OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线如图2，回归方程为y=1. 022x-0. 0157。

3.2.2 4个菌株纤维素降解酶活力比较

由图3可知，所获得4株可产生明显透明圈的真菌菌株中，11号菌株酶活力明显高于其它3个菌株，下一步可对11号菌株的产酶特性的研究展开深入研究。

3.3 真菌鉴定结果

通过分离纯化培养获4个真菌菌株，对其菌落特征（颜色，菌落质地、生长速度等）观察，采用压片法对每个菌株的孢子形态、产孢结构等形态结构在显微镜下观察，并查阅相关文献[9]，11号菌株为枝孢霉属（Clados-porium sp.），14号菌株为镰孢属（Fusarium sp.），15号菌株为漆斑霉属（Myrothecium sp.），29号菌株为青霉属（PeniciILium sp.）（图4）。

4 结论与讨论

本实验通过利用羧甲基纤维素钠培养基和刚果红透明圈染色法，初步筛选出4株能够产生透明圈且具有纤维产降解能力的真菌，其中lI号枝孢霉属（Clados-porzum sp.）酶活力最高，其次是14号镰孢属（Fusari-um sp.），29号青霉属（Penicillium sp.）和15号漆斑霉属（Myrothecium sp.）酶活力值较低。但在透明圈筛选中，14号菌株透明圈比11号大，但其酶活力没有11号高，这可能与菌种在发酵液中培养时生长速度不同而导致产生的菌种的生物量差异而导致产酶量的差异，也可能是不同菌株产生的酶活力对环境因子差异导致。针对以上存在问题，将对11号和14号菌株开展酶生理特性的研究，在揭示二者产酶活力差异同时，为产酶菌株的开发利用奠定理论基础。

参考文献：

[1]Liu DY. Zhang RF，Yang XM，et al.Thermostable cellulase pro-duction of Aspergillus fumigatus 25under solid - state fermenta-tion and its application in degradation of agricultural wastes[J].International biodeterioration&biodegradation， 2011， 65（5）：717 -725.

[2]王丹，林建强，张萧，等，直接生物转化纤维素类资源生产燃料乙醇的研究进展[J].山东农业大学学报（自然科学版），2002（4）：525-529.

[3]2hang Q， Lo CM， Ju LK. Factors Affecting Foaming Behavior in-Cellulose Fermentationby Trichoderma reesei Rut C- 30[J].Bioresource Technology， 2007， 98（4）： 753～ 760.

[4]汪维云，朱金华，吴守一.纤维素科学及纤维素酶的研究进展[J].江苏理工大学学报，1998（3）：20-28.

[5]Soloveva IV， Okunev ON， Vel"kov VV， et al.The SelectionandProperties of Penicillium verruculosum Mutants with EnhancedProduction of Cellulases and Xylanases[J]. Microbiology. 2005，74（2）：141-146.

[6]孫迅，王宜磊，邓振旭，等.四株降解半纤维素细菌的分离和鉴定[J].菏泽师专学报，1997（2）：17～20.

[7]张庆芳，马菁玲，孔秀琴，等.半纤维素酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶条件的研究[J].中国沼气，2015，33（5） ：11～15.

[8]魏 群，生物工程技术实验指导[M].北京：高等教育出版社，2002.

[9]Barron G.I..1964.A new genus of the Hyphomycetes from soil[J]. Mycologia，2016（56）：1～518.

收稿日期：2019-10-29

基金项目：大连民族大学创新训练项目（编号：201812026063）;国家青年科学基金项目（编号：31800007）

作者简介：李季蓉（1997-），女，大连民族大学环境与资源学院学生。

通讯作者：杨红（1978-），女，副教授，博士，主要从事真菌分类方向研究。