筛选产纤维素酶菌株及其产酶条件的优化

摘要[目的]筛选降解菌糠纤维素的菌株，并且优化其发酵条件。[方法]采用纤维素-刚果红培养基进行筛选，筛选出纤维素酶活较高的菌株。通过比较不同氮源、碳氮比例等条件下CMC酶活，研究其最佳发酵条件。[结果]选出一株酶活较高的菌株，命名为N3。其最适有机氮源为豆饼粉，无机氮源是（NH4）2SO4。最适合N3 产酶的（NH4）2SO4∶豆饼粉比例为 2∶4。最适碳源氮源比例为 5∶2。[结论]N3是一株具有研究价值的产纤维素酶的菌株。

关键词 纤维素酶；筛选；发酵优化

中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10441-02

基金项目黑龙江省财政预研项目。

作者简介葛江丽（1981- ），女，山东郓城人，工程师，硕士，从事植物生理、微生物和细胞生物学方面的研究。

我国是食用菌生产消费大国。2010年我国食用菌总产量达2 000万t，占世界的70%。在食用菌产业迅猛发展的势头下，随之而来的大量废弃菌糠如何处理又是摆在我们面前亟需解决的问题。长期以来，废弃菌糠一般被废弃、焚烧，这样既浪费资源又污染环境。另外，能源问题已成为人类社会发展的重要制约因素。为了缓解这一危机，发展新型的可再生能源已成为世界各国主要的发展目标。燃料乙醇是目前国际上运用较成功的替代能源之一。有关燃料乙醇的研究和应用已被许多国家摆到重要的战略地位。要想将木质纤维素转化为生物燃料，就要先将其分解成单糖。具有优良性状的产纤维素酶活性菌株的使用，是纤维素资源能否高效利用的关键。

国内虽然有了大量筛选纤维素酶的研究[1]，来自自然界中的土壤、水体、腐殖质及生物体内等环境条件下纤维素酶不断被发掘，但迄今为止，我国仍未很好地解决规模生产纤维素酶的难题。长期以来，酶的产量、比活力低一直是制约纤维素酶实际应用的一个重要原因[2]。因此，不断地筛选高产纤维素酶菌株，对纤维素资源的利用有着重要的意义。笔者从土壤、腐殖质和牲畜粪便中筛选出能够高效降解菌糠纤维素的菌株，以菌糠为碳源，通过比较不同氮源、碳氮比例等条件下CMC酶活，探讨其高效产酶的发酵条件。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集。样品于2014年4月分别采自黑龙江省牡丹江市池塘边的泥地、高速公路旁的泥土、山上的腐殖土、动物粪便和农作物的腐殖堆。

1.1.2培养基。

1.1.2.1赫奇逊营养液。磷酸二氢钾 1.00 g，氯化钠 010 g，硝酸钠 2.50 g，硫酸镁 0.30 g，三氯化铁 0.01 g，氯化钙 010 g，蒸馏水 1 000 ml，pH 7.2 左右。

1.1.2.2纤维素-刚果红培养基。磷酸氢二钾 0.50 g，硫酸镁 0.25 g，微晶纤维素 2.00 g，刚果红 0.20 g，琼脂 4.00 g，蒸馏水 200 ml，pH 7.0。

1.1.2.3以纤维素为唯一碳源的固体培养基。在 100 ml 赫奇逊（Hutchison）营养液中加入微晶纤维素 1.00 g，琼脂 2.00 g。

1.1.2.4以菌糠为唯一碳源的液体培养基。在 50 ml 赫奇逊（Hutchison）营养液中加入菌糠 0.50 g，置于 250 ml 三角瓶中。

1.1.2.5种子培养基。蛋白胨5.00 g，酵母膏1.00 g，硫酸铵3.00 g，磷酸二氢钾1.00 g，硫酸镁0.50 g，氯化钙0.10 g，氯化钠0.10 g，葡萄糖20 g，硫酸亚铁 0.005 g，硫酸锌0.001 4 g，硫酸锰0.001 6 g，氯化钴0.002 g，蒸馏水1 000 ml。

1.1.2.6产酶培养基。菌糠2600 g，硫酸铵1.89 g，磷酸二氢钾 5.31 g，硫酸镁0.30 g，氯化钙0.30 g，吐温1.50 g，硫酸亚铁 0.005 g，硫酸锌0.001 4 g，硫酸锰0.001 6 g，氯化钴0002 g，蒸馏水1 000 ml。

1.2方法

1.2.1产纤维素酶菌株初筛。分别称取土壤等样品 1 g，放入装有玻璃珠和99 ml无菌水的三角瓶中，在摇床中 160 r/min振荡30 min。然后，制成 10-1、10-2、10-3、10-4的各种稀释度的样品溶液。取 10-2、10-3、10-4 3种稀释度的土壤样品溶液各 0.2 ml，用无菌玻璃涂棒在以纤维素为唯一碳源的培养基平板表面轻轻地均匀涂布。将平板置于30 ℃的恒温培养箱中培养 48 h。

1.2.2产纤维素酶菌株复筛。 将初筛分离得到的 36 株菌用无菌牙签分别点接到纤维素刚果红培养基上。 将上述平板置于 30 ℃的恒温培养箱中培养 7 d。选取 7株在纤维素刚果红培养基中生长良好（菌落直径大、透明水解圈大）的菌株，接种于以菌糠为唯一碳源的液体培养基的摇瓶中连续培养 5 d，测定发酵液的酶活力。

1.2.3粗酶液的制备。将上述筛选出来的菌株接种于产酶培养基中，于 28 ℃ 恒温摇床培养 5 d，摇床转速 160 r/min。然后，发酵液经5 000 r/min 离心 10 min，除去菌体后得粗酶液。

1.2.4酶活力测定。

1.2.4.1标准曲线的绘制。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml葡萄糖于5支试管中，均用蒸馏水稀释至2 ml，加3，5二硝基水杨酸显色剂2 ml，在沸水浴中煮沸显色10 min，冷却，稀释5倍。以1 ml蒸馏水代替糖作空白管，在550 nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.4.2样品测定。取浓度0.5%羧甲基纤维素钠溶液0.5 ml、酶液0.5 ml于50 ℃水浴中糖化30 min，取出，立即于沸水浴中煮沸10 min，使酶失活，得糖化液，冷却，加入2 ml显色液，再沸水浴10 min，冷却后加水定容稀释5倍，混匀，550 nm测OD值。

1.2.5纤维素分解菌液态发酵条件优化。

1.2.5.1氮源对产酶的影响。在碳源固定在2333 g/L的情况下进行氮源对产酶影响的试验。每瓶氮源含量为2 g/L，得到最佳的无机和有机2种氮源。

1.2.5.2氮源比例对产酶的影响。在总量为2 g/L的情况下将2种氮源按质量比6∶0、5∶1、4∶2、3∶3、2∶4、1∶5和0∶6混合，比较不同比例氮源的产酶效果。

1.2.5.3碳氮比例对产酶的影响。在碳源固定在2333 g/L的情况下，氮源依次为133、267、400、533、667、800、700、1067 g/L，得到最佳产酶碳氮比。

2结果与分析

2.1纤维素分解菌的筛选通过以纤维素为唯一碳源的固体培养基筛选得到的36株菌株中，有19株来自池塘边的泥地，11株来自山上的腐殖土，5株来自高速公路旁的泥土，1 株来自农作物的腐殖堆。 将上述 36 株菌株接种于纤维素刚果红培养基上，7 d后观察其生长情况（表1）。

部分菌株如C11、C12虽然可以在纤维素刚果红培养基上很好的生长，但几乎没有透明圈产生，说明这些菌株可以利用纤维素为碳源，但并非通过水解产生单糖或多糖这一代谢途径，而是有其他非水解途径。

2.2摇瓶筛选选取表1中菌落大小水平和水解圈大小水平都较高的 7 株菌株，接入以菌糠为唯一碳源的液体培养基中，培养5 d后，菌株N1、N2、N3、N4、T1、T2、F1 CMC酶分别为2.31±0.31、3.58±0.21、22.47±0.32、21.39±0.21、11.17±0.23、10.66±0.12、9.23±0.08。菌株N3的CMCase最高，所以下面的试验以菌株N3为研究对象。N3在纤维素刚果红培养基上形成的透明圈见图1。

2.3培养基成分对产纤维素酶的影响

2.3.1氮源的影响。 氮是组成蛋白质和核酸的主要元素。酶的本质是蛋白质。微生物的生长代谢也离不开氮源。虽然氮源不作为诱导纤维素酶的诱导物，但其种类对产酶有较大的影响。由图2可知，在提供的氮源中，N3产CMC酶的最佳无机氮源是（NH4）2SO4，有机氮源是豆饼粉。所以，选用（NH4）2SO4和豆饼粉作为N3的最佳无机、有机氮源。

2.3.2氮源比例的影响。由图3可知，当（NH4）2SO4 和豆饼粉比值为（6∶0）～（2∶4）时，CMC酶缓慢增加，到2∶4时N3产CMC酶增至最大。所以，N3产酶最佳氮源（NH4）2SO4 和豆饼粉比值为 2∶4。

2.3.3碳氮比例的影响。由图4可知，当氮源含量为 0.28 g时CMC酶最高（23.068）。所以，N3的最佳产酶氮源含量为 0.28 g。此时，碳源、氮源的比例为 5∶2。