磺胺二甲嘧啶对脊尾白虾抗氧化酶活性的影响

材料。因此，脊尾白虾是一种理想的测试生物体，可用于监测和评价海洋水体环境和质量变化及水体污染状况。本研究的脊尾白虾在磺胺二甲嘧啶（sulfadimidine，SM2）暴露胁迫下，观察体内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等酶活性变化及其体内丙二醛（MDA）含量的变化，评价GSH-Px、CAT、SOD活性和MDA含量作为磺胺二甲嘧啶暴露的生物标志物的适用性，为抗生素对虾类的早期损伤和应急反应筛选出有效的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 试验材料

脊尾白虾取自江苏省连云港市忠玉水产养殖场，虾体长（5.34±0.15） cm，体质量（2.97±0.13） g。本试验于2017年3月中旬至4月中旬于淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室进行。试验前选择健康的脊尾白虾放入室内水族箱中驯养 7 d 以上，驯养期间，每日换水1次，并在自然死亡率低于2%的情况下选择身体健康、大小一致的脊尾白虾进行试验。

抗生素磺胺二甲嘧啶购于Sigma-Aldrich公司（St. Louis，MO，美国），纯度≥99%;助溶剂为0.1 mol/L NaOH。

1.2 毒性试验

对脊尾白虾幼体进行静水养殖，按等对数间距设置5个磺胺二甲嘧啶浓度，分别为50、158、500、1 580、5 000 μg/L 和空白对照组，试验容器为10 L容量的聚乙烯塑料箱，每组溶液放置20尾脊尾白虾和7 L海水且每个浓度设置3个重复，期间保持不间断充气。在培养期间1、3、7、15 d时分别取3尾虾，解剖后取肝胰腺置于离心管中，做好标记并在-20 ℃冰箱中冷冻保存。

1.3 组织匀浆制备

将各时期取样的肝胰腺在冰浴中与0.86%生理盐水用玻璃匀浆器制成10%匀浆，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，取上清液用于测定蛋白含量及各种酶活性。

1.4 蛋白含量及酶活性测定

采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒并按说明书测定组织蛋白含量及各种酶活性。

1.5 数据处理

酶活性采用平均数±标准偏差（x±s）表示，采用SPSS统计软件进行数据分析，用方差分析（A-NOVA）法分析试验组与对照组之间的差异，并用Student-Newman-Keuls检验法分析组间显著性，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 磺胺二甲嘧啶对脊尾白虾CAT活性影响

不同浓度磺胺二甲嘧啶暴露对脊尾白虾肝胰腺CAT活性的影响见图1。暴露于158、500 μg/L磺胺二甲嘧啶的脊尾白虾，其CAT活性随暴露时间延长表现为先增加后下降的趋势，且在3 d时受显著诱导后达到最高值，分别为对照组的236、3.41倍，随后逐渐下降。5 000 μg/L浓度组则表现为CAT活性随暴露时间的增加而下降，且在15 d时被显著抑制。1 580 μg/L浓度磺胺二甲嘧啶浓度组脊尾虾肝胰腺CAT活性也在15 d时被显著抑制。50 μg/L浓度组表现为CAT活性与对照组无明显差异。

2.2 磺胺二甲嘧啶对脊尾白虾SOD活性影响

暴露于不同濃度磺胺二甲嘧啶1、3、7、15 d后，脊尾白虾肝胰腺SOD活性变化见图2。50、158 μg/L浓度组脊尾白虾SOD活性在1 d时被显著诱导且达最高值，随后整体逐渐下降。500 μg/L浓度组SOD活性在3 d时显著上升，为对照组的3.58倍，随后下降。1 580、5 000 μg/L浓度组在3 d时SOD活性被显著诱导且达最高值，分别为对照组的2.68、322倍，随后逐渐下降且在15 d时被显著抑制。

2.3 磺胺二甲嘧啶对脊尾白虾GHS-PX活性的影响

在不同浓度磺胺二甲嘧啶暴露条件下，脊尾白虾肝胰腺GHS-PX活性变化如图3所示。暴露于50、158、500 μg/L磺胺二甲嘧啶浓度组的脊尾白虾GHS-PX活性先上升后下降，且在3 d时达到最高值，分别为对照组的3.05、343、3.65倍。1 580、5 000 μg/L浓度组GHS-PX活性则表现为随着暴露时间的延长先升高后降低，且在15 d时被显著抑制。

2.4 磺胺二甲嘧啶对脊尾白虾MDA含量的影响

暴露不同浓度的磺胺二甲嘧啶1、3、7、15 d后，脊尾白虾肝胰腺MDA含量变化见图4。暴露于50、158、500 μg/L 浓度组的脊尾白虾MDA含量在1～3 d时无显著性变化，从7 d开始上升且在15 d时被显著诱导且达最高值，分别为对照组的3.49、4.05、4.22倍。而1 580、5 000 μg/L浓度组MDA含量则表现为先增加后下降的变化趋势，且均在3 d时达到最高值，分别为对照组的3.77、3.96倍。

3 讨论

抗氧化防御系统存在于所有需氧生物细胞内，可清除物质代谢过程中产生的活性中间产物，在正常情况下，SOD、CAT、GPX等抗氧化酶联合作用清除产生的活性氧自由基[8]。SOD是生物体抗氧化防御系统的关键酶。SOD可催化 O-2 ·

发生歧化反应生成H2O2，防止过多的活性氧积存对机体造成氧化损伤[9]。CAT则与GPX一起清除H2O2，进而阻断可产

生活性极高的羟自由基。CAT通过催化过氧化氢分解为水和氧气，防止过氧化氢与体内的氧气在铁螯合物作用下反应生成有害的—OH，是生物防御体系的关键酶之一。一些病原体可以通过产生CAT来分解生物机体内的过氧化氢，维持细胞内氧化还原的平衡状态，从而保证它在机体内正常生活[10]。GHS-PX也是生物机体内重要的抗氧化酶，能消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂。本研究中，158、500 μg/L组CAT和GHS-PX活性表现为先增加后降低的趋势，且在3 d时受到显著诱导并达到最高值。高浓度（1 580、5 000 μg/L）组的CAT和GHS-PX活性则表现为在15 d时被显著抑制。可能由于磺胺二甲嘧啶胁迫导致脊尾百虾机体内产生大量活性氧自由基，CAT和GHS-PX活性迅速增加可保护机体免受自由基的伤害。随暴露时间的延长，CAT和GHS-PX活性的下降可能是由于大量活性氧自由基产生，且超过机体清除活性氧自由基的能力，使细胞受到更严重的损伤，最终导致CAT活性受到抑制。此外，本研究中不同浓度组SOD活性的基本变化趋势是先增加后降低。500 μg/L 浓度组SOD活性在3 d时显著上升随后下降，而 1 580、5 000 μg/L浓度组则在3 d时SOD活性显著被诱导随后逐渐下降且在15 d时被显著抑制。这主要是由于磺胺二甲嘧啶胁迫会导致机体内产生大量的活性氧自由基，SOD活性的迅速增加可以保护机体免受自由基的伤害。随着暴露时间的延长，CAT活性下降可能导致大量的活性氧自由基产生，且超过机体清除活性氧自由基的能力，使细胞受到更严重的损伤，最终导致SOD活性受到抑制。同时，本结果可推测磺胺类药物对脊尾白虾机体造成的氧化损伤可能主要发生在暴露的前3 d。这与磺胺类药物对罗非鱼的暴露试验[6]基本一致。

丙二醛是自由基攻击膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化作用的最终分解产物，与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联，导致细胞损伤[11-13]。正常生理状态下，体内的MDA含量极低，可间接反映机体的活性氧自由基和脂质的过氧化水平，可提示细胞受损伤的程度。本研究中，50、158和500 μg/L浓度组MDA含量表现为随暴露时间的延长而增加，在15 d时被显著诱导达最大值，与沼水蛙蝌蚪在有机磷农药的暴露下MDA含量也随着时间和浓度的增加而上升[14]和氨氮胁迫下脊尾白虾MDA含量随暴露时间的延长而增加[15]类似。而1 580、5 000 μg/L浓度组MDA含量则表现为先上升后下降且在3 d时达最大值，与磺胺类药物对罗非鱼肝脏组织中的MDA变化[6]相似。分析原因，可能由于低浓度组在前期暴露过程中虽然活性氧自由基增加，但并未对细胞造成严重的损伤，而随暴露时间延长，活性氧自由基的大量增加，超过机体的清除能力，并对机体细胞造成较为严重的损伤。表明磺胺类药物的长期胁迫会破坏脊尾白虾的抗氧化系统，导致机体清除自由基能力降低，过多的活性氧使机体脂质过氧化程度加剧，MDA含量随之增加。

参考文献：

[1]于 淼. 养殖业中磺胺类药物残留的危害及现状[J]. 现代畜牧科技，2015，2（2）：133.

[2]谢美萍，颜 勇. 水体中3种磺胺类药物对斑马鱼的生态毒性效应[J]. 环境科技，2015，28（2）：30-34.

[3]Holm J V，Ruegge K，Bjerg P L，et al. Occurrence and distribution of pharmaceutical organic compounds in the groundwater down gradient of a landfill[J]. Environmental Science and Technology，1995，29（5）：1415-1420.

[4]Sengelov G，Agerso Y，Halling-Sorensen B，et al. Bacteria antibiotic resistance levels in Danish farmland as a result of treatment with pig manure slurry[J]. Environmental International，2003，28（7）：587-595.

[5]徐维海，朱校斌，王新亭. 抗菌药物在鱼、虾体内的残留及代谢动力学研究[J]. 海洋科学，2004，28（9）：62-65.

[6]王 奇，范灿鹏，陈锟慈，等. 三种磺胺类药物对罗非鱼肝脏组织中谷胱甘肽转移酶（GST）和丙二醛（MDA）的影响[J]. 生态环境学报，2010，19（5）：1014-1019.

[7]高 焕，薛 蓓，赵 莲，等. 脊尾白虾应答温度变化的5种因子活性分析[J]. 淮海工学院学报（自然科学版），2014，23（4）：72-75.

[8]吉 红，周继术，曹福余，等. DHA对鲤抗氧化能力影响的初步研究[J]. 上海海洋大学学报，2009，18（2）：2142-2149.

[9]Halliwell B，Gutteridge J C. Free radicals in biology and medicine，5th edition[M]. New York：Oxford University Press，2015：77-152.

[10]赵大显. 中华绒螯蟹表达序列标签（EST）分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究[D]. 上海：华东师范大学，2009：7-10.

[11]Papadimitriou E，Loumbourdis N S. Exposure of the frog Rana ridibunda to Copper：impact on two biomarkers，lipid peroxidation，and gulathione[J]. Bulletin of Environmental Contaimination and Toxicology，2002，69（6）：885-891.

[12]張成玲，杨冬静，赵永强，等. 镰刀菌胁迫对不同甘薯品种抗氧化酶及MDA含量的影响[J]. 江苏农业学报，2017，33（2）：263-266.

[13]张春云，曹丽萍，杜金梁，等. Nrf2介导姜黄素对四氯化碳诱导鲫鱼肝损伤的保护作用[J]. 江苏农业学报，2018，34（1）：114-121.

[14]钟碧瑾，姚 丹，刘娟娟，等. 两种有机磷农药对沼水蛙蝌蚪抗氧化系统及MDA浓度的影响[J]. 福建师范大学学报（自然科学版），2009，25（2）：91-96.

[15]任 海，李 健，李吉涛，等. 急性氨氮胁迫对脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）抗氧化系统酶活力及GPx基因表达的影响[J]. 农业环境科学学报，2014，33（4）：647-655.王馨悦，陈华国，周 欣. 6种常见食材抗氧化及抑制乙酰胆碱酯酶活性[J]. 江苏农业科学，2019，47（15）：208-212.