基于离子液体双水相萃取番茄中抗氧化酶研究

材料与方法

1.1 材料

过氧化氢酶（2 000 U/mg）购自上海士锋生物科技有限公司;磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、30%过氧化氢H2O2、磷酸氢二钠（Na2HPO4）均为分析纯，购自北京化工厂;氯代1-丁基-3-甲基咪唑（[C4mim]Cl），氯代1-乙基-3-甲基咪唑（[C2mim]Cl），四氟硼酸1-丁基-3-甲基咪唑（ [C4mim]PF4）均为分析纯，购自上海爱纯生物有限公司。

1.2 仪器

Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore公司）;涡旋混匀器（德国IKA公司）;紫外可见分光光度计（日本Hitachi公司）;恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;PB-10型pH计（德国Sartorius公司）;离心机（德国Eppendorf公司）;Synergy Mx酶标仪（美国 Bio-Tek公司）。

1.3 方法

1.3.1 离子液体双水相萃取抗氧化酶。

准确称取一定量的离子液体和K2HPO4，加入到10 mL刻度比色管中，加水溶解，溶解完全观察到体系分为上下两相（图1），上相富集离子液体，下相富集K2HPO4。用不同pH的缓冲溶液调节体系的酸碱度[22]，加入0.5 g研磨成浆的番茄泥，番茄位于两相中间（图2），于30 ℃、200 r/min恒温培养箱中振荡一定时间后静置，取上清液进行酶活性测定。

1.3.2 缓冲液法萃取分离抗氧化酶。

参考文献[23]，基于缓冲溶液法对5种抗氧化酶进行提取：取新鲜的番茄，洗净晾干，于搅拌机中打碎10 min，再冰浴状态下用研钵研磨至泥状。分别配制pH 7.8的50 mmol/L PBS，缓冲溶液提取CAT、SOD、POD三种抗氧化酶和pH 6.0的50 mmol/L PBS缓冲液提取AAO、PPO两种抗氧化酶，取4.5 mL酶提取液加入0.5 g研磨成浆的番茄泥，在4 ℃高速离心机中以 5 000 r/min的转速离心30 min，取上清液放入4 ℃环境中待用。

1.3.3 抗氧化酶活性测定。

过氧化氢酶（CAT）活性测定：通过测定1 min内H2O2在240 nm波长下消耗量，可计算得CAT活性[24];抗坏血酸氧化酶（AAO）活性测定：通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活性;多酚氧化酶（PPO）活性测定：PPO 能够催化邻苯二酚产生醌，后者在 410 nm 有特征光吸收[23];过氧化物酶（POD）活性测定：采用愈创木酚法测定[25];超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：采用核黄素（NBT）法测定[26]。

2 结果与分析

2.1 萃取参数优化

2.1.1 离子液体种类和用量的选择。

研究以CAT活性为考察指标，对提取条件进行优化。将[C4mim]Cl、[C2mim]Cl及[C4mim]PF4与K2HPO4制备成相同浓度的双水相体系，分别加入相同浓度的酶溶液进行提取，通过检测酶活性考察不同离子液体的提取效果。由图3可知，[C4mim]Cl双水相提取的酶活性最高，其次为[C2mim]Cl，[C4mim]PF4提取效果最差，因此选择[C4mim]Cl作为双水相体系中的离子液体。

制备浓度为0.26～0.47 g/mL的[C4mim]Cl离子液体双水相体系，固定体系pH、提取时间以及K2HPO4的加入量，对离子液体的用量进行考察。由图4可知，在较低浓度时，酶的提取效果较差，随离子液体浓度的提高，酶活性逐渐升高，当浓度达0.40 g/mL时，提取效果最好，之后随着离子液体浓度升高，酶活性逐渐降低，因此离子液体浓度应控制在0.40 g/mL。

2.1.2 K2HPO4加入量的选择。

随着盐量的增加，上下相体积比逐渐减小，盐浓度过高或者过低，均不能形成双水相。由此可知，无机盐是双水相体系成相的主要原因之一，控制盐浓度为0.10～0.24 g/mL，保持pH不变，对CAT活性进行测试。由图5可知，随着盐浓度的增大，提取效果逐渐提高，在0.16 g/mL时达到最大。随着无机盐浓度增大，盐析作用加强，酶更趋向于分配上相，但过多的盐导致酶的活性下降，因此，盐浓度最优值为0.16 g/mL。

2.1.3 双水相体系pH的确定。

配制pH为6.5～9.5的离子液体双水相体系，考察体系中不同pH条件对酶活性的影响。由图6可知，在离子液体溶液双水相体系中，当pH<7.5和pH>7.5 时，酶活性均较低，在酸性或碱性条件下接近酶的等电点导致溶解性变差，部分析出致使酶活性下降。故试验中为保持酶的活性，双水相体系的pH应保持在7.5左右。

2.1.4 萃取和静置时间的确定。

准确称取0.5 g番茄泥于制备好的离子液体双水相体系中，充分混合均匀后，置于30 ℃、200 r/min的恒温培养箱中提取CAT，通过考察不同萃取时间和静置时间对提取的酶活性差异，确定最佳的萃取时间和静置时间。由图7可知，随萃取时间增加，酶活性逐渐增加，當萃取时间达20 min后，酶活性逐渐稳定，因此萃取时间选择为20 min。

在确定萃取时间的条件下，考察不同静置时间下提取的CAT活性的差异。由图7可知，酶活性随着静置时间的增加而升高，并在15 min时达到最高，之后由于放置时间的延长部分酶失活，导致酶活性有所下降，故选取的静置时间为15 min。

2.2 离子液体双水相法与缓冲溶液提取法的对比

对传统的缓冲溶液提取法与离子液体双水相法进行对比。由表1可知，离子液体双水相萃取得到的CAT、SOD、AAO、PPO这4种抗氧化酶活性高于传统的缓冲溶液提取法。由于该研究以[C4mim] Cl/K2HPO4形成上相富集离子液体和下相富集无机盐的双水相体系，基于盐析作用蛋白质水溶液在高浓度的中性盐中会析出产生沉淀，得到的蛋白质一般不失活，一定条件下又可重新溶解，基于配位作用蛋白质上的氨基酸会和离子液体发生配位反应，从而大大增强了蛋白质在离子液体中的溶解度，使蛋白质富集在上相的离子液体中[9]。然而，离子液体双水相法提取的POD活性低于缓冲溶液提取方法，可能是由于离子液体双水相体系pH较高，导致了部分酶活性丧失，后期将继续对POD酶提取条件进行优化，但离子液体双水相法提取的POD其标准差小于传统方法得到的酶活性的标准差。总体来说，离子液体双水相萃取法优于传统的缓冲溶液提取方法，且得到的酶活性更加稳定，该方法受到的外界干扰更小。

3 结论

该研究基于[C4mim]Cl/K2HPO4双水相体系，建立了萃取分离番茄中5种抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）的新方法。以抗氧化酶活性为指标，对离子液体的种类及浓度、提取时间、无机盐的用量、体系pH、萃取时间等条件进行了优化，并与传统的缓冲溶液提取法相比较。结果表明提取番茄中抗氧化酶的最佳条件是采用浓度为0.40 g/mL[C4mim]Cl离子液体，K2HPO4浓度为0.16 g/mL，pH为7.5，萃取时间为20 min，静置时间为15 min。该研究建立的离子液体双水相提取方法成功提取了番茄中5种抗氧化酶，酶活性比传统提取方法高（除POD外），且稳定性较好，萃取时间缩短了10 min。该研究提出了一种基于离子液体双水相体系的快速、高效、高活性的抗氧化酶分离方法。

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