分光光度法检测酶促反应中底物的量

摘 要：在化学实验中酶促反应是十分常用的反应方式，我们时常利用这种反应方式来对底物的量进行检测。由于酶自身所具有的特性，应用这种反应方式我们可以知道，当酶与底物进行结合之后，反应液中会出现游离的氨基酸逐渐的增多这一现象，并且反应液中所存在的游离氨基酸其自身的含量与底物的含量相同，因此利用这一方式我们可以有效的确定出底物的量，利用这一特性我们可以建立分光光度法，利用这一方法更加快捷的对底物的含量进行检测。

关键词：分光光度法 酶促反应 底物 分析与讨论

中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）06（a）-0151-02

酶检测法由于其自身的特异性较强，所以在进行化学实验的过程中常常会被应用在结构的分析或是进行化学性质的鉴定，利用这种方式来进行底物的量的检测过程中无须进行相对于复杂的预处理，其自身的检测速度比起其他的方式更加的快速，根据实际检验可以知道现阶段的蔗糖酶α-淀粉酶、己糖激酶或是糖化酶这三种酶自身都可以用作这一实验反应的过程中，并且利用这一方面来进行底物的量的检测专一性更强，灵敏度也更高，在进行底物的量检测过程中我们可以利用分光光度法进行检测，这样可以提高检测的效率，更加方便我们进行检测，本文的主要目的就是对分光光度法检测酶促反应中底物的量进行简单的分析和讨论。

1 实验材料与实验的方法

1.1 实验所用的主要材料

在进行实验的过程中其主要的材料有以下几种：α-淀粉酶、可溶性的淀粉、DL-苹果酸、蔗糖酶、NACL、NA2HPO4、NAH2PO4。在进行实验的过程中，要求实验用水必须为双蒸水。

1.2 实验的方法

在进行实验的过程中我们首先需要对溶液进行配制，然后需要根据不同的环境和反应下对实验反应进行测定和记录。

1.2.1 实验所用的溶液的配制

有关蔗糖酶溶液在进行实验的过程中的配制方式：首先在进行实验之前抽取一定量的蔗糖酶将其溶于PBS的缓冲液中，要求PBS的缓冲液其自身为pH6.9，浓度为0.02mol/L对其进行配置，将其分别的配成溶液中的质量分数约为0.02%～0.028%的蔗糖酶溶液。

有关蔗糖溶液在进行实验的过程中的配制方式：首先在进行实验之前抽取一定量的蔗糖，将其分别的溶于PBS的缓冲液中，要求两个PBS的缓冲液其自身的pH不同，而浓度均为0.02mol/L，并且将其制成PH质量分数为8.1%的蔗糖溶液以及pH为7.9的0.021%～0.076%的蔗糖溶液。

有关茚三酮溶液在进行实验的过程中的配制方式：首先在进行实验之前称取0.52g的茚三酮，并将其溶于体积为100mL的双蒸水中，得到5.2g/L的茚三酮水溶液，并将其保存在棕色瓶中。

1.2.2 在酶促反应中生成游离的氨基酸的测定

在对酶促反应中所生成的游离的氨基酸进行测定的过程中，我们需要做到的是在比色管中分别加入体积为1mL的蔗糖酶溶液以及体积为1.5mL的蔗糖溶液，在反应完全之后分别在两个比色管中加入1mL，5g/L的茚三酮溶液，然后将两个比色管放入温度为95℃的水中进行时间为30min的水浴，水浴结束后需要将两个比色管进行避光处理，时间为1h，最后在波长为570nm的分光光度计中测定其自身的吸光度，在实验中我们也可以利用PBS的缓冲溶液来代替蔗糖溶液作为实验中的空白对照。

1.2.3 温度对于游离氨基酸含量的影响

在进行实验的过程中为了测量温度对于游离氨基酸含量的影响，我们需要将体积为1.0mL，含量为0.02%的蔗糖酶溶液以及体积为1.5mL的pH值为6.9的8.00%的蔗糖溶液进行实验测量，将两种溶液分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃中进行时长为1min的预热，然后每组3个平行，反应的时间均为2min，以此来测量温度对于游离氨基酸含量的影响。

1.2.4 pH值对于游离的氨基酸含量的影响

将含量为8.00%的蔗糖溶液与含量为0.02%的蔗糖溶液分别进行配置，将其配置成pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的溶液，然后比色管放在温度为50℃的环境下进行时长为2min的反应，然后在波长为570nm的分光光度计中测定其自身的吸光度。

2 实验结果与分析

2.1 游离的氨基酸含量的测定结果

在反应结束后分别取含量为0.10%的蔗糖酶以及含量为0.08%的蔗糖、含量为0.20的α-淀粉酶、含量为0.60%的淀粉溶液，对其进行分组反应以此来测定反应液中游离氨基酸的含量，如图1所示。

从图1中我们可以清楚的看出，蔗糖、蔗糖酶、α-淀粉酶、淀粉这4种溶液中其自身的游离氨基酸含量十分的少，而在酶与底物进行反应之后其反应液中所含有的游离氨基酸的量明显增多。

2.2 反应的温度对于游离氨基酸含量的影响

在实验的进行过程中随着温度在不断的升高，随着温度的升高，蔗糖酶反应液中其自身的吸光度首先会随着温度的不断增加进行缓慢的增加，在增加到一定的值之后开始逐渐的降低，为此在进行温度的选择过程中不能够过高也不能够过低，为此选择50℃来作为蔗糖酶的酶促反应是最佳的反应温度，如图2所示。会出现这种现象的原因有两点。

2.2.1 温度的升高导致分子运动速率加快

分子运动的速度会随着温度的增高而增快，这样就直接加快了分子的碰撞概率使得反应的速率加快，同时也就直接的提高了反应液中游离氨基酸的含量。

2.2.2 温度的升高会导致酶蛋白变形失活

一旦在进行反应的过程中酶蛋白变形失活就会导致酶促反应速率的降低，这就是温度的升高会导致吸光度逐渐的降低的原因。

2.3 pH值对于游离的氨基酸含量的影响

在进行实验的过程中随着蔗糖溶液自身的PH增大，其反应液的吸光度会出现先逐渐增大而后逐渐的减小，如图3所示可以知道其自身吸光度最大时反应液的pH值为8。在进行底物的pH选择过程中需要我们从多方面来进行考虑，由于pH不同会影响酶促反应、影响茚三酮的显色反应同时也会对游离的氨基酸含量有影响，所以在进行pH的选择过程中需要我们综合的考虑到每一个方面。

3 结语

根据本文综上所述可以知道，在进行酶促反应的过程中利用分光光度法来进行底物含量的检测可以有效的帮助我们更为准确的确定好数据，同时简化操作的困难性，以蔗糖酶来作为实例可以知道，根据该方法自身的线性回归方程：y=324.57x+0.0124（R2=0，9876），利用这种方法我们可以检测出其方法检出限为：36，17μg/mL，其自身的相对标准偏差约为2.3%～5.7%，而回收率约为96.54%～101.28%。利用淀粉酶自身的线性回归方程来进行计算可以达到相同的结果，其自身的方法检出限约为127μg/ml；其自身的相对标准偏差约为2.56%～5.47%，其自身的加标回收率约为95.76%～100.98%，由此可见利用分光光度法来进行底物的监测其这一方法的系統误差相对于小，并且在进行数据的测定中更为准确。

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