19株白酒大曲及酒糟中红曲菌的酯酶同工酶分析

红曲菌（Monascus sp.）能够产生红曲色素、Monacolin类化合物、γ-氨基丁酸、酯酶等代谢物，故其在我国的食品行业、中医药行业中有悠久的应用历史和广泛用途。在酱香白酒发酵中，红曲菌是霉菌类微生物的主体之一通过其一级代谢物酯化酶的作用，在酿酒过程中有产酒产香功能，有利于酱香型白酒风味物质的形成，其在白酒酿造中仍有巨大的应用价值。

本文从对酱香型白酒大曲、酒糟和浓香型白酒大曲中分离的红曲菌菌株，进行了酯酶同工酶酶谱分析，为当地红曲菌微生物资源的保护和利用的进行了有益探索。

材料与方法

供试菌株。从贵州仁怀某酒厂提供的酱香型白酒大曲及酒糟及四川宜宾某酒厂提供浓香型白酒大曲中分离鉴定了19株红曲菌。采用中国工业微生物菌种保藏管理中心购买红曲霉标准菌株3株、和实验室留存菌株3株作为对照。

主要仪器。恒温水浴摇床，超净工作台，冷冻离心机，蛋白质电泳仪。

酯酶同工酶电泳。将供试红曲菌株经过增殖、收集菌体研磨，加入磷酸缓冲液并离心收集上清液备用。参照NY/T 1097- 2006的方法，分离胶浓度7%，浓缩胶浓度5%。电泳条件为稳流电泳，采用稳流电流，电流为1.5 mA/cm，待指示液进入分离胶后调整电流为2.5 mA/cm。停止电泳后以α、β-醋酸萘酯和固蓝RR盐染色，7%的醋酸溶液固定。

数据处理。按同工酶酶谱中同一位点条带的有无建立矩阵。采用NTSYS- 2.0软件，以UPGMA聚类法进行聚类分析。

结果与讨论

红曲菌酯酶同工酶酶谱。对酯酶同工酶电泳条件基本一致的情况下，经过多次电泳所得电泳谱带重复性基本相同。如图1所示。

由图2可知，供试的25个菌株的酯酶同工酶酶谱具有多样性，表现出9种不同的表型，基本可以区分不同的菌种。各菌株可分辨的酶带为1～6条，共有16个不同的带位，迁移率范围为0.26～0.57。

经形态学初步鉴定为紫色红曲菌的酯酶同工酶酶谱分为了6种不同的表型，而其中M11、M4的酶谱与其余表型有明显区别，可能属于另外一个种。形态学初步鉴定为烟色红曲菌的酯酶同工酶酶谱共出现3种不同的表型，且三种表型比较相近，可能为同一种的不同亚种，初步鉴定为红色红曲菌的菌株MR1与标准菌株531同工酶表型相近。

聚类分析。利用NTSYS- 2.0软件包对25个菌株的同工酶谱带矩阵数据进行UPGMA聚类分析，并构建树状图（见图2）。

在相似水平55%處，供试菌株划分为2个明显不同的类群：Ⅰ类为经形态鉴定为紫色红曲菌的类群（M5～M9），Ⅱ类为经形态鉴定为烟色红曲菌的类群（Q5～MY8）及经形态鉴定为红色红曲菌的类群（MY3～MR1）。在相似水平77%处，供试菌株可划分为5个群。I类紫色红曲菌可进一步分为3类。II类烟色及红色红曲菌可划分为单独的2类。这与形态鉴定结果基本一致。

（1）不同来源的红曲菌株所产酯酶多样性丰富，不同种类菌株之间有明显差异，表示菌株间产酯酶特性的差异，这为红曲菌及其酶制剂在酱香型/浓香型白酒发酵中的深入研究提供的基础。（2）依据酯酶同工酶电泳酶谱，对不同来源菌株的相似度进行聚类分析，其结果与形态鉴定结果基本一致，能够为红曲菌的鉴定提供参考。

基金项目：贵州省科技计划项目（黔科合平台人才[2016]5243- 02号）