嗜水气单胞菌对黄鳝血清中四种抗病相关酶活性的影响

摘要：为了研究嗜水气单胞菌感染对黄鳝非特异性免疫和抗氧化功能的影响，将60尾黄鳝平均分成4组（对照组，处理组Ⅰ、处理组Ⅱ、处理组Ⅲ），处理组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别腹腔注射浓度为1×108cfu/ml、2×108cfu/ml、4×108cfu/ml的嗜水气单胞菌菌液，对照组注射等浓度生理盐水，测定各组在感染菌后12h、24h、48h血清中溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶等四种酶活性。结果显示，在感染初期，与对照组相比，各处理组四种酶活力有不同程度的升高；处理组Ⅱ和处理组Ⅲ的溶菌酶有先升高后降低的趋势；酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力在48h内总体上持续升高，但在后期升高不明显，酸性磷酸酶活力有下降的趋势； 总超氧化物歧化酶处理组Ⅲ则呈现先升高后降低的趋势。结果表明，在感染嗜水气单胞菌初期，黄鳝非特异性免疫相关酶活力随菌液浓度升高而升高；而在感染后期酶活力下降。

关键词：黄鳝；嗜水气单胞菌；酶活性

中图分类号：S943文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）01-0039-05国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.01.007

Effect of Aeromonas hydrophila on the activity of four immune-related enzymes in the sera of Monopterus albus

ZHANG Zhao， TU Jiao， QIN Han， ZHANG Wei， HUANG Yunnan， ZHANG Xiaoxue*

（Department of Aquaculture， Collage of Animal Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025，P. R China）

Abstract：In order to study the effect on immune and antioxidant function of Monopterus albus after infection by Aeromonas hydrophila， 60 Monopterus albus were divided into 4 groups （control group and three treatment groups： group I， group II and group III）. The group I， group II and group III were injected with concentrations of 1×108cfu/ml， 2×108cfu/ml and 4×108cfu/ml Aeromonas hydrophila suspensions， respectively. The activities of the four immune-related enzymes of lysozyme， acid phosphatase ， alkaline phosphatase and total superoxide dismutasein serum were measured at 12h， 24h and 48h after infection， respectively. The control group was given the same concentration of saline. The results showed that in the early stage of infection， the four enzymes in the treatment groups increased in different degrees， compared with the control group. The trend of the lysozyme in the treatment group II and group III was firstly increased and then decreased. Acid phosphatase and alkaline phosphatase activity increased in 48h but later period increase was not obvious， or there was a downward trend for alkaline phosphatase. The total superoxide dismutase in treatment group III increased at first and then decreased. At the early stage of Aeromonas hydrophila infection， the immune-related enzyme activity increased together with the increase of the concentrations of the bacteria and the activity of the enzyme became weaker in the later stage of infection.

Key words：Monopterus albus； Aeromonas hydrophila； enzymatic activity

黃鳝（Monopterus albus）俗称鳝鱼或田鳗，属合鳃目（Synbranchiformes），合鳃科（Synbranchidae），黄鳝属（ Monopterus），广泛分布于亚洲地区。因肉嫩味鲜，营养价值甚高，且具有药用价值，黄鳝养殖业的规模在逐年扩大，然而随之而来的疾病爆发也越来越严重[1]。出血病是黄鳝养殖过程中最常爆发，危害最严重的疾病，该病发病速度快，死亡率高，传染性强，为黄鳝养殖业造成巨大的经济损失[2]，对黄鳝养殖的健康发展构成极大地威胁。嗜水气单胞菌是黄鳝出血病的主要致病病原菌[3]，溶菌酶作为鱼类非特异性免疫物质之一，具有使细菌裂解的重要作用[4]；酸性磷酸酶是溶酶体的重要组成成分，且和肝功能密切相关[5]；碱性磷酸酶是机体代谢过程中的关键酶[6]，超氧化物歧化酶是机体内重要的氧化自由基清除剂[7]。方晨等[8]对感染本实验室分离的嗜水气单胞菌后黄鳝部分脏器酸性磷酸酶和碱性磷酸酶两种酶的活性变化进行了初步研究。由于不同来源的菌株对不同的鱼类毒力有区别，因此本研究采用标准嗜水气单胞菌菌株感染黄鳝，考察其对黄鳝血清中溶菌酶、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）等四种酶活性的影响，以期进一步认识嗜水气单胞菌对黄鳝抗病功能的影响，进而为阐明嗜水气单胞菌对黄鳝的致病机理等提供参考数据。

山地农业生物学报2018年第1期张钊，等：嗜水气单胞菌对黄鳝血清中四种抗病相关酶活性的影响1材料和方法11实验动物与菌株

实验用60尾黄鳝（1045±131）g采集于贵州贵阳花溪地区池塘和田间，实验用嗜水气单胞菌ATCC7966。

12主要试剂

酶检测试剂盒购于南京建成生物公司。

13方法

131感染菌液制备制备LB固体培养基，将嗜水气单胞菌ATCC7966涂抹在培养基上，复壮后转移到LB液体培养基中，28℃恒温摇床培养24h，用平板计数法测定菌液浓度。稀释菌液浓度至4×108cfu/ml备用。

132实验分组与处理清洗消毒养殖水箱。将黄鳝随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和对照组，每组15条，放入水箱用不含有嗜水气单胞菌和氯的水适应性饲养2天。对照组每尾注射02ml生理盐水。其余3个处理组，每尾黄鳝注射02ml嗜水气单胞菌菌液，其浓度分别为：处理组Ⅰ组1×108cfu/ml、处理组Ⅱ组2×108cfu/ml、处理组Ⅲ组4×108cfu/m；注射后用酒精棉球对注射部位进行消毒，然后放入水箱中饲养，并加盖防逃。

133取样与酶活测定分别在注射嗜水气单胞菌后12h、24h和48h 3个时间点对各组取血样，每组随机挑选5条，断尾取血，收集血清，放入4℃冰箱过夜，第2天取出2500r/min离心10min，取上清液，用试剂盒测定血清中溶菌酶、AKP、ACP、总超氧化物歧化酶的酶活性。

14数据处理

利用EXCEL和SPSS 150软件进行数据处理与分析，P<005为差异显著，P>005为差异不显著，P<001为差异极显著。

2结果与分析21嗜水气单胞菌感染后黄鳝外观变化

在感染嗜水气单胞菌初期，黄鳝活动正常，体表无明显病变特征，解剖未发现脏器异常。感染24h后，活动缓慢，最高浓度组有死亡2条，黄鳝体表出现细小血点，解剖可见腹腔有腹水，脏器颜色变浅，个别有细小血斑。感染48h后黄鳝活动无力或死亡，体表粘液增多，并布有血斑，肛门红肿，挤压腹部有大量腹水溢出；解剖可见脏器充血肿胀，且有质地变脆腐烂现象。

22嗜水气单胞菌感染对黄鳝血清中溶菌酶活性的影响

如图1所示，在感染嗜水气单胞菌后，各组黄鳝血清中溶菌酶活力在48h内不断升高；与对照组比较，处理I组酶活力变化不明显，处理组Ⅱ在12和24h显著上升（P<005），处理组Ⅲ在感染12h显著上升（P<005），在24h极显著上升（P<001），但3组均在48h与对照组差异不明显。

23嗜水气单胞菌感染对黄鳝血清中ACP活性的影响

如图2显示，感染嗜水气单胞菌后各组黄鳝血清中ACP活性在48h内不断升高；与对照组比较，处理组ⅠACP活性在24h时显著上升（P<005），处理组II在12h时显著上升（P<005），处理组III ACP在12、24h时均显著上升（P<005），但3组均在48h与对照组差异不明显。

从图3可以看出，感染嗜水气单胞菌后，处理组Ⅰ和处理组Ⅱ黄鳝血清中AKP活力持续升高，处理组Ⅰ在感染48h时AKP活力升高极显著（P<001），处理组II在感染48h时出现显著升高（P<005）而处理组Ⅲ12h升高，后出现显著（24h）和极显著（48h）下降。

25嗜水气单胞菌感染对黄鳝血清中T-SOD活性的影响

如图4所示，在感染嗜水气单胞菌后，除处理组Ⅲ48h外，各组黄鳝血清中T-SOD活性不断升高，与对照组比较，处理I组个时间点差异不明显，处理II组48h明显升高（P<005），处理III组在24h时显著升高，在48h时则显著下降。

3结论与讨论溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶属于鱼体的体液免疫因子，在鱼体免疫过程中发挥重要的作用。在受到外界抗原侵入时会快速合成并分泌到血液中，通过检测其在血液中的活性可反映鱼体免疫过程的规律和健康状态[9]。

31嗜水气单胞菌感染后黄鳝组织病理学变化

本实验结果显示，在感染嗜水气单胞菌24h后，黄鳝出现明显染病症状，组织病理变化主要表现为体表及组织器官出血变性，细胞坏死，导致器官功能衰竭直至死亡。有研究表明发病呈急性过程，在感染9h后即出现明显病变症状[10]；而本实验在感染12h后，黄鳝并未出现明显病变症状，这可能与本实验选择在温度较低的秋末有关，延长了黄鳝的发病时间，但是组织病理的变化与其一致，说明了低温对嗜水气单胞菌的感染有抑制作用。在感染初期，黄鳝组织病理变化不显著，而四种酶的活性相比对照组变化也不显著，而在感染后期，黄鳝组织器官受损变化显著，黄鳝血清中四种酶的活力变化显著。这从侧面说明了四种酶的活力变化与黄鳝脏器功能变化密切相关。

32嗜水气单胞菌对黄鳝血清溶菌酶活力的影响

溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，并使之裂解而被释放，从而消除侵入体内的异物。该酶不仅能杀灭革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌还可使病毒失活[11]，因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。本研究结果证实感染嗜水气单胞菌后，黄鳝血清中溶菌酶活性显著升高，说明在感染嗜水气单胞菌后，黄鳝非特异性免疫功能得到增强。处理组Ⅱ和Ⅲ在感染24h后溶菌酶活性都比对照组高，但有随时间下降的趋势，这可能是嗜水气单胞菌在体内24h后的繁殖程指数生长模式[12]，超出了黄鳝自身的防御能力，使酶活性降低。当然，影响溶菌酶活力的因素还有很多，比如季节、温度、PH值、水质等都会对其有所影响[13]，这可能就是对照组在48h内也有升高趋势的原因，但对本实验研究分析其活性变化趋势无太大影响。

33嗜水气单胞菌感染对黄鳝ACP活力的影响

ACP是溶酶体的重要组成成分，与溶酶体参与细胞凋亡功能密切相关[14]。感染嗜水气单胞菌后，日本鳗鲡血清中的ACP的活性明显升高[15]。喷洒蛭弧菌后，草鱼血清和肝脏中的ACP活性都有所升高[16]。对于黄鳝感染嗜水气单胞菌，有关研究表明，黄鳝肝脏中ACP活力有随着菌液浓度呈先升高后降低变化规律，随着时间同样呈现了先升高后降低的趋势[8]。本研究结果也显示了在感染嗜水气单胞菌后初期，黄鳝血清中ACP活力也有升高的趋势，但总体上随时间延长并没有降低的趋势，而是在后期趋于不变；且随浓度的升高，ACP活力在后期也趋于不变，或有少许升高，可能是由于实验季节和温度的原因，使嗜水气单胞菌毒性有所下降。处理组Ⅱ組在24h的活力相比12h有所下降，但降低不显著，总体趋势并未下降，而是在后期升高，说明感染后期，黄鳝机体细胞凋亡加快，需合成分泌更多ACP参与细胞的凋亡。

34嗜水气单胞菌感染对黄鳝血清AKP活性的影响

AKP和ACP一样是溶酶体的重要组成成分，并且和钙磷的代谢有直接联系，正常情况下，血清中的AKP含量远远低于肝脏，但是如果肝脏功能受到损伤时，肝脏内的AKP就会释放到血液中，从而导致血液中AKP含量或者活性升高[17]。有研究表明，在感染嗜水气单胞菌后，黄鳝脏器中的AKP活力都有显著升高，但在48h后没有差异性变化[8]。本研究发现，低浓度的菌液处理后，黄鳝血清中AKP活力程持续升高趋势，这与之前的研究并无矛盾，这可能是由于季节和温度造成的黄鳝免疫能力不同，使黄鳝应急反应的时间有延长。处理III组高浓度的菌液处理在感染初期也有升高趋势，但是在24h后有不断下降的趋势，这说明在處理初期，黄鳝肝脏即受到损伤，AKP大量释放到血液中，使得血清中AKP活力增加，但高浓度菌液处理24h后，黄鳝肝脏功能下降，AKP含量降低，释放到血清中的AKP随之降低，这与解剖发现的肝脏肿胀充血的现象相吻合，导致AKP活力增加后呈现持续下降的趋势。

35嗜水气单胞菌感染对黄鳝血清T-SOD的影响

超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，其活性与生物的免疫水平密切相关，是机体对抗氧化应激反应的第一道屏障，对于及时消除机体内氧自由基，增强吞噬细胞的防御能力和整个机体的免疫功能有重要作用[18]。本研究结果中，各组在感染嗜水气单胞菌后超氧化物歧化酶活性都有明显的上升，这与张伟妮所研究的感染嗜水气单胞菌后日本鳗鲡血清中超氧化物歧化酶的活力的变化相似[15]。但在感染嗜水气单胞菌48h后，处理组Ⅲ黄鳝血清T-SOD活性显著下降，而赵静在以嗜水气单胞菌感染齐口裂腹鱼后也得到了相同的结果，其原因推测是过高浓度的菌液和感染时间过长导致黄鳝组织器官严重受损，引起代谢紊乱，从而使机体抗氧化能力下降[19]。

参考文献：

[1]李明峰，王汝英黄鳝Monopters albus（Zuiew）病害研究进展[J]. 现代渔业信息，2004，19（6）：6-8

[2]汪启寿黄鳝养殖过程中的常见病害防治技术[J]海洋与渔业，2014（247）：74-75

[3]瞿国才 黄鳝出血病的诊断与治疗[J]. 中国水产，1997（10）：23

[4]Bayne C J， Gerwick L The acute phase response and innate immunity of fish[J]. Developmental & Comparative Immunology， 2001， 25（8-9）：725-743

[5]Pipe R K Hydrolytic enzymes associated with the granular haemocytes of the marine mussel Mytilus edulis[J]. Histochemical Journal， 1990， 22（11）：595-603

[6]何忠伟，宫春光，殷蕊，等水中Mn（Ⅱ）对大菱鲆幼鱼生长及碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影响[J]. 水产科学，2016，35（04）：364-369

[7]张笑天，郑晓瑛氧化自由基清除剂超氧化物歧化酶与疾病[J]. 中国公共卫生，2014，30（10）：1349-1352

[8]方晨，王霞，张小雪 嗜水气单胞菌对黄鳝内脏器官酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的影响[J]. 科学养鱼，2015（09）：54-55

[9]Chu F EHumoral defense factors in marine bivalves[A]. Fisher W S.Disease processes in marine bivalve molluscs.Bethesda，Maryland： American Fisheries Society Special Publication，1988（18）： 178-188

[10]何智，任红梅，杨德英，等 嗜水气单胞菌源黄鳝出血病的组织病理学研究[J]. 淡水渔业，2010，40（04）：56-61

[11]卢冬梅，王霆 溶菌酶的抗病毒作用及其抗艾滋病病毒应用[J]. 广东药学，2005（05）：62-64

[12]杨国钊，叶红，容庭 嗜水气单胞菌生长曲线的测定及药物敏感性试验[J]. 畜牧兽医科技信息，2011（09）：27-30

[13]刘加慧，杨洪帅，王辉 持续高温对吉富罗非鱼幼鱼消化酶和溶菌酶活力的影响[J]. 广东海洋大学学报，2013，33（06）：47-51

[14]赵凯，卫涛涛 溶酶体与细胞凋亡[J]. 生命科学，2011，23（11）：1063-1068

[15]张伟妮，林旋，王寿昆，等 人工感染嗜水气单胞菌对日本鳗鲡血清酶活力的影响[J]. 淡水渔业，2012，42（01）：20-23

[16]张梁，沈建忠，敖茂权，等 蛭弧菌对草鱼免疫相关酶活性的影响[J]. 江西农业大学学报，2006（02）：295-299

[17]程春 黄鳝血液生理生化指标的研究[D]. 南昌：江西农业大学，2014

[18]高杉，董颖，王摆，等 仿刺参铜锌超氧化物歧化酶基因全长cDNA的克隆及表达分析[J]. 水产科学，2014，33（05）：288-295

[19]赵静，王利 齐口裂腹鱼感染嗜水气单胞菌后血清指标的变化[J]. 水产科学，2015，34（03）：178-181