椰子乙酰CoA羧化酶（ACC）基因的鉴定及表达分析

摘要[目的]克隆椰子的乙酰CoA羧化酶（ACC）基因。[方法]通过已发表的椰子转录组注释结果，鉴定潜在的椰子ACC基因。分析ACC基因在椰子果肉和嫩叶混合样转录组中的RPKM值，同时，采用实时定量PCR技术研究5个高RPKM值的ACC基因在椰子果肉发育的不同时期的表达情况。[结果]共获得21个椰子的ACC基因，这21个ACC基因在椰子果肉和嫩叶混合样品中有较高的表达量，4个ACC基因（Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1）在椰子果肉发育9个月时表达量最高。[结论]该研究为解析椰子脂肪酸积累的分子机制提供了前期工作基础。

关键词椰子；转录组；ACC基因；实时定量PCR

中图分类号S667.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）35-0128-02

Abstract[Objective]To clone acetyl CoA carboxylase （ACC） genes in Cocos nucifera. [Method] Based on the coconut transcriptome data， to identify potential coconut ACC genes.We examined the RPKM value of ACC genes in coconut leaf and fruit transcriptome.Realtime quantitative RTPCR was applied to test expression level of 5 ACC genes in different developmental stages of coconut fruit， which had highest RPKM value in coconut fruit.[Result]A total of 21 coconut ACC genes were identified. The 21 ACC genes showed high expression level in a mixture sample from coconut pulp. 4 ACC genes（Unigene7806，Unigene47155，Unigene7847 and CL185.Contig1） showed the highest expression during the development of the coconut pulp for 9 months. [Conclusion]These study provided basic work for elucidating the molecular mechanism of fatty acid biosynthesis of coconut.

Key wordsCocos nucifera；Transcriptome；Acetyl CoA carboxylase；Realtime quantitative PCR

椰子是一種重要的热带油料和水果木本作物，椰子树全身是宝，椰子水可以饮用，椰子肉含有丰富的脂肪酸，椰子可以榨油，此外，椰子富含纤维，常被用来制作床垫。椰子在热带地区又被称为“生命之树”。椰子油的脂肪酸成分非常特殊，以中低碳链脂肪酸为主，特别是12碳的月桂酸，大约占椰子脂肪酸总量的50%。

脂肪酸合成的前体为乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA为底物进行连续的聚合反应，进一步合成16～18碳的饱和脂肪酸。ACC脂肪酸生物合成的关键酶之一在自然界中有2种存在形式：一种为多功能酶，另一种为多酶复合体。前者含有3个功能结构域，催化乙酰CoA合成丙二酰CoA，被称为真核生物的ACC酶，而另一种形式的ACC酶可分解为不同功能的酶蛋白，如生物素羧化酶（BC）、生物素羧基载体蛋白（BCCP）、羧基转移酶（CT）及另一个未知功能的酶，被称为原核形式的ACC酶 [1]。目前已从硅藻、拟南芥、苜蓿、小麦、玉米、油菜、小麦和水稻中分离出ACC基因，这些ACC基因都为真核形式，它们对除草剂非常敏感，植物中ACC酶受光和酰脂CoA调节，光可能通过改变基质pH、ATP、ADP和镁离子等参与调节酶活性，增加叶片脂类形成，从而影响脂肪酸的合成 [2-3]。

该研究依据椰子的转录组数据，从中鉴定椰子的ACC基因序列，采用定时定量PCR技术研究这些ACC基因在椰子果肉发育不同时期的表达变化，并研究不同时期椰子果肉脂肪酸的积累。

1材料与方法

1.1椰子ACC基因的鉴定

椰子的转录组数据从NCBI（the National Center for Biotechnology Information）的TSA（Transcriptome Shotgun Assembly）数据库中下载，而拟南芥的ACC基因从TAIR（the Arabidopsis Information Resource）网站上下载，为了鉴定椰子的ACC基因，用拟南芥的ACC基因序列与椰子的转录组序列进行比对，比对的E值得阈值为1e-10，用预测的椰子的ACC蛋白质序列与CDD（http：//www.ncbi.nlm.gov.cdd）和PFAM数据库（http：//pfam.sanger.ac.uk）进行对比。基于不同物种ACC基因的氨基酸序列，采用MEGA 5.0软件分析不同物种ACC基因的聚类关系[4-5]。

1.2椰子果肉RNA的提取

海南当地高种授粉后8、9、10、11月，分别取果肉，并采用MRIP的方法提取果肉中的RNA。

1.3逆转录和荧光定量PCR

将5 μL的mRNA与1 μL的Oligo（dT）18混合，加入6 μL的ddH2O，将此混合液置于水浴锅60 ℃变性5 min，然后迅速置于冰水混合物中5 min，接着在混合液中，加入4 μL的Buffer溶液、1 μL的逆转录酶、2 μL的10 mmol/L dNTP和1 μL的RNA酶抑制剂，42 ℃放置1 h，然后70 ℃灭活5 min。接着将逆转录的溶液稀释10倍，按照以下配制定量体系：cDNA模板2 μL、左引物（10 μmol/L）1 μL、右引物（10 μmol/L）1 μL、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL和ddH2O 8.5 μL。荧光定量PCR的反应程序为95 ℃ 30 s，然后40个重复单元，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。

1.4RPKM值的测定

采用Trinity软件[6]对椰子转录组的短序列进行拼接，RPKM值的计算参考Mortazavi等[7]的方法。

2结果与分析

2.1椰子ACC基因的鉴定

从TAIR网站上下载拟南芥的ACC基因，用这些基因比对椰子的转录组序列，阈值设置为1e-10，在椰子的转录组中，一共有21个Unigenes与拟南芥的ACC基因具有较高的同源性，分别是Unigene47794、Unigene51833、Unigene9101、Unigene5061、Unigene9100、Unigene20855、Unigene55201、Unigene2455、Unigene24212、Unigene47795、Unigene20854、Unigene44914、Unigene44815、Unigene43715、Unigene47497、Unigene44874、Unigene48396、Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1。這些Unigenes长度最短的为Unigene44914，其基因长度为212 bp，最长的为Unigene44815，其基因长度为7 375 bp，这些基因的平均长度为1 422 bp。

2.2ACC基因在转录组中RPKM值分析

对这些ACC基因的RPKM值进行计算，结果显示：这些基因在椰子嫩叶和果肉转录组中都有较高的表达，其中8个Unigenes在椰子嫩叶和果肉转录组中的RPKM值低于10，包括Unigene47794（1.931 8）、Unigene51833（1.958 2）、Unigene9101（2.389 8）、Unigene5061（2.971 3）、Unigene9100（3.111 1）、Unigene20855（5.136 6）、Unigene55201（7.153 5）、Unigene2455（9.149 8），CL185.Contig1在椰子嫩叶和果肉转录组中的RPKM值最高，为102.115 2。这些ACC基因的平均RPKM值为25.176 0。

2.3ACC基因在椰子果肉发育不同阶段的表达分析

在椰子授粉后8、9、10、11个月分别提取果肉中RNA，并研究5个RPKM值最高的Unigenes在这4个时期的表达变化，它们分别是Unigene48396、Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1，其RPKM值分别为36.192 0、45.136 2、58.956 8、66.631 3和102.115 2。由图1可知，Unigene7806、Unigene47155、Unigene7847和CL185.Contig1在椰子果肉发育的不同时期表达模式较为一致，这4个基因在椰子果肉发育9个月时，表达量最高，然而Unigene48396在椰子果肉发

育到9个月时表达量最低，在椰子果肉发育到11个月时表达量最高。这些结果暗示椰子果肉发育9个月是椰子脂肪酸合成中起始底物大量积累的时候。

3讨论

该研究应用拟南芥ACC基因的序列，与椰子的转录组序列进行比对，鉴定了21个与拟南芥ACC基因高度同源的椰子Unigenes，并依据椰子果肉与嫩叶混合样的转录组数据，对这21个ACC基因RPKM值进行计算，结果显示：这些ACC基因在椰子果肉和嫩叶的混合样品中有较高的表达量，根据RPKM值，筛选了5个高表达的Unigenes，并研究了这5个Unigene在椰子果肉发育4个不同时期（椰子果肉发育8、9、10、11个月）的表达量。在这5个ACC基因中，有4个ACC基因在椰子果肉发育9个月时，表达量最高。

ACC酶能催化脂肪酸合成的第一步反应，Gengenbach等[8]发现在黄豆发育的中期和早期，高油黄豆中ACC基因的表达量为低油黄豆中的2倍多，可见，在黄豆发育的中期和早期，ACC基因的高表达对脂肪酸的积累和含油量的积累非常重要，同时过量表达ACC基因能显著增加植物和种子中的含油量。Ohlrogge等[9]将油菜储藏蛋白的启动子连接到拟南芥的ACC基因，并将其转化到油菜中能显著增加油菜的含油量 。Sellword等[10]通过反义表达技术抑制油菜ACC基因的表达，对转基因油菜和野生型油菜的含油量进行调查，转基因油菜种子含油量显著高于野生型油菜种子的含油量。该研究表明，ACC基因在椰子果肉中有高的表达量，尤其是在椰子果肉发育早期表达量最高。

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