反义药物的开发与研究进展

反义药物是近20多年来发展起来的一种以反义核酸技术为基础开发的以治疗为目的安全有效的新型药物。反义药物（Antisense drugs）指的是反义脱氧寡核苷酸类药物，主要包括反义DNA（AS-ODN），反义RNA（AS-ON），多肽核酸（PNA），核酶（ribozymer）等。其主要是根据碱基互补配对原则和核酸杂交原理，利用人工合成、天然存在的互补寡核苷酸片段，以反向互补方式特异性地与目的基因（单链、双链）或信使核糖核酸（mRNA）的特定序列相结合，从基因复制、转录、剪接、转运翻译等水平上调节靶基因的表达，干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递，从而达到抑制、封闭或破坏靶基因表达，达到治疗疾病的目的。因此，反义药物是对多种疾病都有潜在治疗价值的新型药物。自1978 年Stephenson 和Zamenick首次报道与病毒核酸序列互补的13mer反义寡聚脱氧核苷酸能够抑制Rous病毒复制，提出了反义寡聚脱氧核糖核酸能够抑制特定基因表达的概念，并预测了在治疗病毒性疾病和癌症方面的前景。

伴随着核酸治疗技术的发展，反义药物的开发与研究逐步展开，许多药物开发公司开始采用反义原理将寡核苷酸药物用于阻止一种特异性疾病相关的蛋白的表达，因为寡核苷酸能够阻止或破坏负责该蛋白合成的信使RNA（mRNA）。世界上首个经批准上市的反义药物是美国Isis制药公司生产的福米韦生（Vitravene,ISIS2922），分别于1990年经欧洲药品评价局（EMEA）批准在欧洲上市和1998年经美国药品与食品管理局(FDA)在美国上市。该药由21个硫代磷酸酯寡核苷酸组成，是用于治疗艾滋病病人并发的巨细胞病毒性（CMV）视网膜炎。由于福米韦生是直接通过眼内注射给药，所以不存在反义药物进入靶组织剂量不足的问题。

通过研究人员在试验中进行一系列的化学改进，反义药物的功效已得到明显的提高并且许多公司取得了突破。尤其是在发现了RNA干扰机制——在植物和动物体内的一种天然反义机制之后，先后成立了诸如Alnylam制药公司(Alnylam Pharmaceuticals, Inc.)和Sirna治疗制剂公司（Sirna Therapeutics）等制药和生物治疗制剂公司，它们正在开发被称作短干扰RNA(siRNA) 的合成双链RNA,并将其作为高效价的反义药物。最近，人们又认识到，siRNA在细胞内不会受到称作RNA诱导沉默复合体（RISC）的一种特异机制的损伤，并且RISC是2条RNA链（反义链）中唯一能与mRNA靶结合并激活的一条链。另外，研究人员还认识到，像锁核酸（LNA）等RNA类似物可作为单链高亲和力的反义药物。进入临床试验阶段的第三代核酸治疗制剂包括双链（siRNA）和单链（LNA）寡脱氧核苷酸化合物。

第一代RNA抑制剂

第一代反义药物是由合成DNA单体制成的。它经修饰后仅含一种硫磺物质，以替代核苷酸之间磷酸连接的氧分子。迄今，由于这种称作硫代磷酸酯变体的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸（PS-ODN）在遇到组织核酸酶时能提高药物的稳定性，并且能延长血浆的半衰期，所以它广泛应用于多数寡脱氧核苷酸类药品中。例如Isis制药公司生产的福米韦生和Genta 制药公司目前再次向美国食品与药品管理局（FDA）递交了新药申请（NDA）的奥利默森纳(oblimersen sodium，Genasense)均为DNA 硫代磷酸酯类药物。由于它们对靶RNA的结合亲和力较弱并对核酸酶消化产生连续的不适当抗性，所以它们的主要问题是相对缺乏潜能。据有关研究报道，在灵长类动物的试验中DNA硫代磷酸酯制剂出现的急性毒性也限制了其用药剂量。迄今，在分别对7种DNA寡脱氧核苷酸制剂进行的III期临床试验中，有6种因难以达到最初的设计要求而终止，仅有Gentia制药公司的奥利默森纳注射液在对复发性或不应期慢性淋巴细胞白血病(CLL)病人进行的临床III期试验中达到了最初的设计要求，并2006年3月该公司有向FDA递交了将奥利默森纳注射液加氟达拉滨（fludarabine，Fludara ）和环磷酰胺（cyclophosphamide，Cytoxan ?）合用治疗复发性或不应期慢性淋巴细胞白血病的申请，目前正在审批之中。Gentia制药公司曾于2003年12月向FDA递交了将奥利默森纳注射液加达卡巴嗪（dacarbazine，DTIC-Dome?）合用治疗晚期黑素瘤的申请，2004年5月，未得到FDA的批准，该公司撤回申请。但是，该公司于2006年1月又向欧洲药品局(EMEA)递交了将奥利默森纳注射液加化疗制剂治疗晚期恶性黑素瘤的申请，目前，正在审批之中。另外，还有数中DNA寡脱氧核苷酸制制剂正在进行II期临床试验，具体见表1。

面对DNA寡脱氧核苷酸制剂在临床试验中出现的种种问题，许多制药公司并未气馁，在继续进行临床研究的基础上，还进行了多种尝试，例如通过增加针对核糖的 2’-Ｏ-烷基化（2’MOE）修饰、吗啉化、磷酰胺酯化（NPs）、肽核酸（PNA）核酸锁（(LNA)、六环核酸或三环DNA等多种方式，对反义药物的骨架结构进行适当修饰，从而提高了反义药物的靶标亲和力、核酸酶抗性，减少其毒副作用，避免产生免疫反应；另外，还通过对一些重要的化学制剂改造，改善反义药物的稳定性，增加了口服、灌肠等新给要途径，从而推出了第二代反义药物。

第二代反义药物

第二代反义药物包括2’-O-烷基硫代磷酸酯药物和2’-O-甲基与吗啉类似物药物（见表2和表3）。在开发第二代反义药物的制药公司中，仍以美国Isis制药公司为首。该公司将诺华制药公司的2’MOE化合物加入到寡脱氧核苷酸制剂中。含有全或部分2’MOE衍生单体的寡脱氧核苷酸制剂可以提高药物潜能和通过减少免疫刺激提高耐受性,增加对核酸酶降解的抗性,有助于减少用药量和延长用药间隔时间。Isis制药公司已将该技术应用于开发治疗包括糖尿病等心血管病多种疾病的药物。另外，该公司还与其他共合作，共同开发含有2’MOE的寡脱氧核苷酸制剂，已先后向癌基因技术公司（OncoGenex Technologies Inc.）和反义治疗制剂公司(Antisense Therapeutics Limited)颁发了丛属许可证，使这2家公司也加入到含有2’MOE的寡脱氧核苷酸制剂研发队伍之中。但是，研究人员在研究中发现，与DNA寡脱氧核苷酸制剂相比，尽管含有2’MOE的寡脱氧核苷酸制剂提高了稳定性，但是表明仅在与DNA结合的亲和力方面有一定的改进。

第三代反义药物

第三代反义药物分为2类：一类是双链短干扰RNA(siRNA)，另一类是单链核酸锁(LNA)寡核苷酸（见表4和表5）。在细胞培养的转染制剂提呈过程中，对于靶mRNA和蛋白，用低于1纳米摩尔浓度的双链 siRNA和单链LNA寡核苷酸都产生重要的还原反应。与第一代和第二代反义药物相比，尽管在体内试验中都能到达作用的部位，但这第三代反义药物的药效要明显得多，并且预示着良好的临床应用前景。遗憾的是，未经修饰的siRNA在体内具有不稳定性，在循环过程中双链体易解旋并受到核酸酶的降解。然而，这对于作为外用药来说并不是一个大问题。的确，美国的Acuity制药公司（Acuity Pharmaceuticals）拥有最先进的siRNA临床研究计划，如采用一种滴眼液Cand5治疗与年龄相关的湿性视网膜黄斑变性（AMD）。目前，该公司正在对这种滴眼液进行II期临床试验。另外，该公司还正在用该滴眼液对糖尿病性视网膜疾病进行临床前期试验。该产品的设计是用来使导致AMD病人失明的促进视网膜新血管形成的血管内皮生长因子基因（VEGF）失活的。此外，Alnylam制药公司开发的用于治疗呼吸道合胞体病毒（RSV）感染的siRNA制剂ALN-RSV01目前也正在进行I期临床试验。

相比之下，当用硫代磷酸连锁将RNA类似物和核酸锁连接起来时，它们对核酸酶裂解产生显著的抗性，并且延长了组织的半衰期。此外，LNA寡核苷酸与RNA结合具有相当高的亲和力。与第一代和第二代反义药物相比，第三代反义药物的这些特性是其提高疗效的关键因素，并明显增加了其体内疗效的潜能。根据2005年12月Santaris制药公司在美国血液学会召开的会议上所作的报告中提供的数据，一种可直接作用于低氧诱导因子（HFI-1α）mRNA的LNA寡核苷酸制剂在改善组织低氧和血管内皮生长因子蛋白水平等方面似乎比直接作用于相同基因的最佳siRNA更有效。HFI-1α是一种对VEGF和VEGF受体表达起着关键调节剂作用的转录因子，并因此在肿瘤血管生成过程中发挥着重要的作用。此外，HFI-1α还在诸如细胞增殖、凋亡和细胞侵袭等肿瘤的其他生长过程中发挥着重要的作用。siRNA为大双链分子，不易通过细胞膜，所以，其最大技术障碍是进入体细胞内。据Alnylam制药公司报道，通过siRNA与胆固醇缀合至少能够增强肝吸收。Santaris制药公司最近提供的数据表明，直接作用于肝Apo?100的非缀合LNA寡核苷酸可以有效降低小鼠体内Apo?合成和血浆胆固醇水平，其剂量仅是Alnylam制药公司的胆固醇缀合siRNA的1/8。与常规的DNA拮抗剂相比，由于LNA与互补RNA序列具有相当高的结合常数，所以，LNA寡核苷酸可以作为一类新药。因此，Santaris制药公司就将‘RNA拮抗剂’作为新词，用来描述其这类高亲和力结合和靶特异性的药物。目前，致力于研究和开发双链短干扰RNA的生物技术和制药公司主要有美国的Acuity制药公司, Alnylam 制药公司, CvtRv 生物制药公司（CytRx Laboratories, Inc.），Sirna 治疗制剂公司；澳大利亚的贝尼替克澳大利亚有限公司（Benitc Australia Ltd.）；和丹麦的Santaris 制药公司（Santaris Pharma）等。

反义药物的未来

反义药物的研究与发展在很大程度上与抗体药物的发展过程极为相似，例如最早的鼠源性抗体(即第一代抗体)就显示其广阔大前景，但进入市场的产品并不多。然而，随着生物技术的快速发展，鼠源性抗体很快被嵌合体（部分鼠抗体，部分人抗体）所取代，成为第二代与人抗体极为相似的拟人化抗体。它是利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。第三代抗体为全人源化基因工程抗体。目前，药物研究与开发人员正在进一步开发抗体片段、功能抗性抗体和纳米抗体等。到目前为止，全球有超过200家公司正在研发治疗用单抗药物，约有335个产品正在研发中，其中100多个已进入临床试验，美国FDA共批准了24个抗体药物上市。反义药物的研究与开发过程基本亦是如此。在第一代DNA硫代磷酸酯药物中，迄今仅有福米韦生（Vitravene,ISIS2922）这一个产品上市，尽管有一些产品因这样或那样的问题而终止了试验，但仍有数个产品正在进行II期临床试验，并表明其具有良好的开发前景。在开发的第二代反义药物中，包括2’-O-烷硫代磷酸酯和2’-O-甲基与吗啉基类似物2大类药物。它们均为高代谢稳定性和中性效价药物，且其靶标亲和性、对核酸酶的抗性、稳定性等都由于第一代反义药物。基于2’MOE和LNA的第三代产品目前多数都已进入临床前期试验和临床试验。随着临床研究的进展，在不远的将来，人们将看到更有效的基于核酸的定向治疗制剂投放市场。