稀土元素镧对丹参活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响

[摘要]该文研究了镧对丹参毛状根中活性物质积累及其合成途径中酶基因表达的影响，为揭示土壤因子镧影响丹参药材品质形成的环境机制奠定基础。采用HPLC测定丹参毛状根中活性物质含量；采用Tiangen多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取RNA，采用Takara反转录试剂盒合成cDNA，采用PCR荧光定量试剂盒进行实时定量分析，采用SPSS软件进行数据分析。结果显示镧处理对丹参毛状根内丹参酮类和酚酸类的积累表现出显著的促进效应，处理后9 d其酚酸类成分含量达到峰值，丹参酮类成分含量随处理时间的延长而增加（15 d内）；镧处理后丹参体内活性物质积累的峰值时间相对滞后于酶基因表达的峰值时期，FPPS，TAT，HPPR 3个酶基因与丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量变化趋势相似，暗示FPPS，TAT，HPPR 3个酶基因在镧诱导的丹参活性物质积累中发挥重要作用。

[关键词]丹参； 毛状根； 活性物质； 关键酶基因

Effect of Lanthanum on accumulation of active constituent and key enzymes expression of Salvia miltiorrhiza hairy root

BIAN Lihua1，3， ZOU Lin1， ZHOU Bingqian1， LIU Wei1， ZHOU Jie1，2*， WANG Xiao1

（1Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology， Shandong Analysis and

Test Center， Ji′nan 250014， China；

2 School of Biological Science and Technology，University of Ji′nan， Ji′nan 250012， China；

3 Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）

[Abstract]The effect of Lanthanum on the accumulation of active constituent and key enzymes expression of Salvia miltiorrhiza hairy root were studied and furthermore signaling molecules mediating the synthesis of secondary metabolism was also defined in order to provide references for the reveal of synthesis mechanism of active constituent of S miltiorrhiza hairy root inducing by Lanthanum The content of active constituents were detected by HPLC RNA was extracted with RNA prep Pure RNA purification kit （Tiangen） The results shows that LaCl3 processing promoted the accumulation of tanshinones and phenolic acids in S miltiorrhiza hairy root The accumulation of phenolic acids reached the highest at 9 d after treatment， and tanshinones accumulation continued to increase in 15 days Accumulation of active substance in S miltiorrhiza may relate with FPPS， TAT， HPPR several key enzyme activation

[Key words]Salvia miltiorrhiza； hairy root； active substance； key enzymes

doi：10.4268/cjcmm20162309

道地藥材是人们传统公认且来源于特定产地的名优正品药材，是中药材的精髓所在，也是历代医家防病治病最有力的武器之一[1]。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效[2]，属于我国常用大宗药材，是临床上治疗心脑血管疾病的要药之一[3]。道地药材品质的形成与生态环境关系密切[4]，而关于丹参道地药材品质形成的环境因子及其作用机制尚未深入研究。

土壤因子是重要的生态因子，也是影响药材产量和品质形成的重要因素[5]。稀土是由原子序数为57～71的镧系元素以及与之性质极为相似的钪、钇共17种元素组成。镧（La）是一种典型的稀土，地壳中镧约为0001 83%，稀土能够影响药材中活性物质的积累[6]。据报道山东丹参道地产区土壤中La达到27 mg·kg-1[7]，丹参中La超过843 mg·kg-1，远高于水稻、玉米、大麦等作物[8]，推测土壤中的镧元素是影响山东丹参道地药材品质形成的重要生态因子。预实验发现La处理后丹参中活性物质的含量发生显著变化，而La影响丹参中活性物质积累的机制尚未深入探讨。本文拟以丹参毛状根为试材，研究La处理对丹参毛状根中活性物质积累及其生物合成途径中关键酶基因表达的影响，探讨丹参中活性成分及其关键酶基因对镧的响应特点，为揭示丹参道地药材形成的环境机制奠定基础。

1材料

采用发根农杆菌菌株Agrobacterium rhizogenes 15834处理丹参叶片获得丹参毛状根，将经PCR鉴定的阳性株系置于67 V液体培养基[9]中培养。精确称取05 g毛状根接种于50 mL培养基，25 ℃，110～120 r·min-1搖床上避光培养。

2方法

21实验处理

毛状根继代培养18 d后，在无菌条件下添加LaCl3使其终浓度达到001 mmol·L-1（浓度由预实验得到），对照加等量灭菌水，每个处理6个重复，分别于处理后1，3，5，9，15 d取样，取样时将毛状根取出后迅速吸干水分，每一取样点取得的样品分为2份，一份样品用液氮迅速冷冻，置-70 ℃超低温冰箱保存备用，用于基因表达分析；另一份迅速超低温冷冻干燥，用于丹参活性物质含量测定。

22毛状根中活性物质含量测定

将干燥后的丹参毛状根研磨过筛，70%乙醇提取，HPLC同时测定迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量[1013]，以乙腈（A）和水（02%乙酸）为流动相，乙腈5%为初始浓度，0～25 min，5%～35% A，25～26 min，35%～100% A。酚酸类成分检测波长为270 nm，丹参酮类成分检测波长为280 nm；柱温25 ℃。

23毛状根中活性物质生物合成中关键酶基因表达分析

231毛状根总RNA提取采用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Tiangen RNA prep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒）提取。采用琼脂糖凝胶电泳法检测RNA纯度和完整性；使用核酸蛋白分析仪（TY10 Biospecnano ZX21）检测RNA浓度。

232实时荧光定量PCR引物序列见表1。采用TaKaRa试剂盒进行反转录，采用琼脂糖凝胶法检测cDNA，采用实时荧光定量PCR仪进行 PCR检测。利用Pfaffi法计算目的基因和内参基因的扩增效率。计算公式为基因表达量=C（A-E）/D（F-B），C，D分别是目的基因和内参基因的扩增效率；A和E分别是对照样品和待测样品中目的基因的Ct；F，B分别是对照样品和待测样品中内参基因的Ct。

24数据分析

用Excel软件处理数据，用SPSS 130软件进行数据分析。

3结果与分析

31RNA提取与检测结果

琼脂糖凝胶电泳显示RNA无蛋白质污染，RNA完整无降解，符合反转录成cDNA要求。核酸蛋白分析仪检测结果显示A260/230，A260/280读数均在18～21，RNA质量浓度均在200 mg·L-1以上，符合反转录成cDNA要求。cDNA琼脂糖凝胶电泳条带清晰且为单一条带说明PCR产物特异性好，无明显引物二聚体，符合Real time实验要求。引物的特异性良好，各引物扩增效率均在适宜范围之内，符合Real time PCR实验要求。

32LaCl3处理对丹参毛状根中活性物质积累的影响

321LaCl3处理对丹参毛状根中丹参酮类成分积累的影响LaCl3处理后1 d二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量均显著高于对照（P<005），处理后3 d其含量略有下降，处理后5～15 d其含量逐渐升高，均显著高于对照（P<005），如二氢丹参酮含量5～15 d分别高出对照6623%（5 d，P<005），5345%（9 d，P<005），2618%（15 d，P<005）。二氢丹参酮、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的含量应对镧的响应表现出较相似的变化趋势。与对照相比LaCl3处理后丹参酮类成分变化趋势总体表现为“升降升”的趋势，见图1。

322LaCl3处理对丹参毛状根中酚酸类成分的影响LaCl3处理对迷迭香酸和丹酚酸B成分的积累表现出促进效应。LaCl3处理后5 d迷迭香酸迅速积累，其含量显著高出对照2859%（P<001）；处理后9 d其含量达到峰值，显著高出对照5626%（P<001）。和迷迭香酸的变化趋势相似，LaCl3处理后5 d丹酚酸B含量迅速上升，显著高出对照3567%（P<001），处理后9 d达到峰值，见图2。

33LaCl3处理对丹参毛状根中关键酶基因表达的影响

331LaCl3处理对丹参酮类成分生物合成途径中关键酶基因表达的影响LaCl3处理对AACT和FPPS表达量的影响较为相似，处理后1 d其表达量迅速上升，分别高于对照4963%（P<005），27364%（P<005）；处理后9 d表达量均低于对照；处理后15 d其表达量分别高出对照19094%（P<005），5058%（P<005）。LaCl3处理对GPPS的表达表现出促进抑制促进抑制的波浪状趋势，其中处理后1，5 d为2个GPPS表达量的高峰，分别高出对照24910%（P<005），11366%（P<005）。LaCl3处理对丹参酮类成分生物合成途径中AACT，FPPS，GPPS 3个关键酶基因的表达均表现出促进和抑制相互交替的波浪线趋势，见图3。

332LaCl3处理对酚酸类成分生物合成途径中关键酶基因表达的影响LaCl3处理对丹参毛状根酚酸类成分生物合成途径中关键酶基因表达的影响见图4。LaCl3处理1 d对PAL表达量未表现出显著影响，处理后3，5 d PAL表达略低于对照组，处理后9 d PAL表达量显著高出对照17875%（P<005）；LaCl3处理后1 d C4H表达量迅速增加，显著高出对照9407%（P<005）。LaCl3处理对4CL的表达总体表现为促进效应；处理后1 d HPPR基因表达量高出对照组39199%（P<005），3 d仍显著高于对照，处理后5 d和9 d HPPR表达量略低对于对照，15 d又出现回升，高出对照6091%（P<005）。LaCl3处理对酚酸类成分生物合成过程中关键酶基因的表达表现出促进和抑制相互交替的波浪线趋势。

34相关性分析

341丹参酮类成分含量及其合成途径中的关键酶基因表达量的相关性分析丹参酮类成分含量及其合成途径中的关键酶基因表达量的相关性分析见表2。AACT，FPPS呈现显著正相关，相关系数为0685（P<005）。FPPS表达量与二氢丹参酮和隐丹参酮含量呈显著正相关关系，相关系数分别为0716（P<005），0750（P<005）。LaCl3处理后，丹参酮ⅡA与隐丹参酮含量之间尚未表现出显著相关性，其余活性成分之间均表现出极显著相关性（P<005）。

342酚酸类成分与关键酶基因相关性分析酚酸类成分和关键酶基因相关性分析结果见表3。相关性分析结果显示迷迭香酸和丹酚酸B之间有极显著相关性，相关系数为0966（P<001）。

4讨论

本文通过研究LaCl3处理后不同时间段丹参酮类和酚酸类积累及其相应的关键酶基因表达量的动态变化，发现镧处理对丹参中丹参酮和酚酸类成分的积累整体表现出促进的效应，其中丹参酮类成分含量随处理时间的延长而增加（15 d内），酚酸类成分含量在处理后9 d达到峰值后又回落。

镧处理后丹参体内活性物质生物合成途径中关键酶基因的表达量表现出明显的变化。FPPS，TAT，HPPR 3个关键酶基因均呈促进抑制相互交替的波浪状变化，该趋势与丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量变化趋势相似，且活性物质积累的峰值时间相对滞后于关键酶基因表达的峰值时期，暗示FPPS，TAT，HPPR关键酶基因在镧处理诱导丹参中活性物质丹参酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B成分积累中发挥重要作用。据报道FPPS是丹参酮类成分代谢途径中的下游基因，其对丹参酮类成分合成影响作用较大。TAT是酪氨酸代谢途径的起始酶，也被公认为是该途径的限速酶[14]。HPPR为酪氨酸代谢途径中第一个使代谢流特异流向迷迭香酸的关键酶[15]。3个酶基因均为代谢途径中与次生代谢产物合成密切相关的关键酶基因，与本实验结果相吻合。相关性结果表明FPPS与二氢丹参酮和隐丹参酮均有显著正相关，且镧处理后1 d FPPS表达量即迅速上升，推测FPPS在镧响应机制中发挥至关重要的作用。除了稀土元素外，土壤中影响药用植物次生代谢产物积累的因子很多，从分子水平上探讨其作用机制是揭示道地药材品质形成的环境机制的重要方面。

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[責任编辑吕冬梅]