普通烟草茄尼基焦磷酸合酶基因NtSPS的克隆和表达分析

材料。自Rowland等首次在烟草中发现茄尼醇以来，茄尼醇在马铃薯、番茄、茄子和辣椒等茄科作物中均有报道，烟草中含量最高；在烟草中，植株不同器官中的茄尼醇含量也不同，以叶中的含量最高，尤其是上部叶。茄尼醇在植物中以游离态和酯型结合态2种形式存在，烟草叶片游离态茄尼醇/总茄尼醇范围为0.18～0.85。为鉴定出富含茄尼醇的烟草品种，本课题组测定了93份烟草种质的茄尼醇含量，发现其含量为1.78-3.60%。最近，向德虎等研究发现，烟草茄尼醇含量的遗传由主基因和多基因共同决定，以主基因遗传为主，同时受到环境的影响。

在植物组织中，茄尼醇是在质体中经由2.甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸（MEP）途径合成的。1-脱氧-5-磷酸木酮糖合成酶（DXS）催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合形成1-脱氧-5-磷酸木酮糖（DXP），DXP在1-脱氧-5-磷酸木酮糖还原异构酶（DXR）的催化作用下，经过分子内重排和还原反应形成MEP；MEP在一系列酶的催化作用下形成异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。IPP在异戊烯基焦磷酸异构酶（IPI）的催化下形成DMAPP，茄尼基焦磷酸合酶（Solanesyl diphosphate synthase，SPS）催化IPP和DMAPP形成茄尼基焦磷酸（SPP），SPP是茄尼醇生物合成的前体物质。目前已在拟南芥、水稻和番茄中鉴定出SPS的同源基因。而烟草中关于SPS的克隆和表达分析的研究未见报道。

本研究分离获得烟草茄尼醇生物合成关键酶基因NtSPSl和NtSPS2，对其进行了序列比对、进化分析、亚细胞定位分析以及表达特性分析，分析了烟草植株不同器官的茄尼醇、叶绿素含量与NtSPS表达水平的相关性，为NtSPS调控烟草茄尼醇生物合成的机制的深入研究奠定基础。

1.材料与方法

1.1植物材料

供试材料为普通烟草品种红花大金元（Nicotiana tabacum cv Honghuadajinyuan）。烟草培养条件为：培养温度25℃，光暗周期14h/10h，相对湿度（70±10）%；土壤条件为：pH 7.2，全氮1.89 eCkg，碱解氮48.3 mg/kg，全磷0.45 g/kg，有效磷32.4 mg/kg，全钾32.5 g/kg，速效钾219mg/kg，有机质7.39 g/kg。移栽后30 d，分别采集根、茎和叶样品。采取混合取样的方法：选择9株有代表性的健康植株，每3株混合，取根、茎、叶，3次重复。

1.2基因克隆

使用GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit（Thermo）提取烟草植株不同器官（根、茎、叶）总RNA。采用PrimerScriptTM RT-PCR Kit（Takara）反转录第一链cDNA，作为PCR扩增的模板。检索中国烟草基因组数据库（http：//218.28.140.17/），得到普通烟草NtSPSl和NtSPS2基因全长CDS，并据其进行相关基因的引物设计（表1），用于扩增普通烟草NtSPSl和NtSPS2基因全长。PCR扩增条件参照文献。将PCR产物检测回收，连接pmdl8-T载体后转化大肠杆菌感受态DH5α。筛选阳性克隆，并送华大基因公司测序。

1.3多序列比对、系统进化和亚细胞定位分析

采用DNAMAN软件将得到的NtSPSl和NtSPS2序列与拟南芥、水稻和番茄SPS进行多序列比对分析；利用MEGA 5.0构建NJ进化树。采用在线程序Predotar和TargetP，分别对NtSPS 1和NtSPS2亚细胞定位预测。

1.4荧光定量表达分析

分别提取烟草植株不同器官（根、茎和叶）的总RNA，去除基因组DNA污染后，稀释到100ug/ul。按照试剂盒说明，利用PrimeScriptTM RTReagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time，Takara）在荧光定量PCR仪ABl7500上进行qRT-PCR分析。所用基因特异引物见表1，以烟草Actin基因作为内参。

1.5茄尼醇含量测定

参照文献方法，进一步优化提取条件后利用超高效液相色谱检测烟草植株不同器官（根、茎和叶）中总茄尼醇和游离态茄尼醇含量，并计算游离态/总茄尼醇。仪器条件为，色谱柱：BEHCl8 1.7um2.1*50 mm，流动相：甲醇+乙腈=50+50，流速：0.5mUmin，柱温：30℃，检测波长：208nm。

1.6叶绿素含量测定

参照文献的方法，测定烟草植株不同器官（根、茎和叶）中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量，并计算叶绿素a，b。

1.7统计分析

试验结果用Excel整理，所有数据在P<0.05水平下进行Tukey多重比较。试验中所有的统计分析在SPSSl8.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）软件中完成。

2.结果

2.1 NtSPSl、NtSPS2基因及其编码蛋白信息

根据中国烟草基因组数据库中检索得到的普通烟草NtSPSl和NtSPS2基因全长CDS，设计相关引物（表1），在普通烟草红花大金元中获得了两个基因的序列，NtSPSl和NtSPS2基因的PCR产物电泳图见图1。NtSPSl和NtSPS2开放读码框（ORF）长度分别为1209、1206 bP，编码氨基酸数目分别为402、401个，DDxxD结构域数目均为2个；在线程序Predotar和TargetP预测结果表明，NtSPSl和NtSPS2均具有叶绿体定位序列，成熟蛋白定位于叶绿体，参与茄尼醇在叶绿体中的合成反应（表2）。

2.2多序列比对和系统进化分析

将得到的烟草SPS与拟南芥、水稻和番茄SPS进行多序列比对（图2）。从图2看出，不同作物中的SPS均存在2个保守的富含天冬氨酸的DDxxD结构域。DDxxD结构域是异戊烯基焦磷酸合酶最典型的保守结构域，它可以结合二价金属离子，参与协调二价金属离子和底物分子二磷酸基团的结合；DDxxD结构域位于催化位点的入口，对反应底物的定位起关键作用。因此，NtSPSl和NtSPS2均具有2个DDxxD结构域，而作为SPS的保守结构域，DDxxD结构域可以确保NtSPS功能发挥。

利用MEGA 5.0对不同物种中的茄尼基焦磷酸合酶（SPS）、聚十异戊烯基焦磷酸合酶（DPS）、栊牛儿基焦磷酸合酶（GPS）、聚六异戊烯基焦磷酸合酶（HPS）和聚八异戊烯基焦磷酸合酶（OPS）进行系统进化分析（图3）。从图3可以看出，NtSPSl、NtSPS2与S1SPSl同源性较高，这与烟草、番茄均为茄科作物有关；相比之下，NtSPSl、NtSPS2与CsSPSl、AtSPSl、AtSPS2、OsSPS2、CrSPSl、NsSPSl、SsSPSl、PmSPSl等同源性较低，这主要与烟草和黄瓜、拟南芥、水稻、莱茵衣藻、鱼腥藻PCC7120、蓝藻、集胞藻PCC6803等亲缘关系较远有关。NtSPSl、NtSPS2与S1GPSl同源性较低，这与SPS和GPS分别用于催化合成C45茄尼基焦磷酸和C10栊牛儿基焦磷酸有关；另外，在拟南芥中AtSPSl、AtSPS2与AtSPS3同源性较低，在水稻中OsSPSl与OsSPS2的同源性较低，这可能与不同SPS基因具有不同的生物催化功能相关，其中OsSPS 1、OsSPS2分别催化合成线粒体中的泛醌和叶绿体中的质体醌。

2.3荧光定量表达分析

从图4可以看出，烟草植株不同器官Ntspsi和NtSPS2的相对表达量差异显著（P>0.05），二者均是叶>茎>根。其中，叶中NtSPSl和NtSPS2的相对表达量分别是茎的7.69倍、4.95倍，茎中NtSPSl和NtSPS2的相对表达量分别是根的10.4倍、12.3倍。由此可见，叶中NtSPSl和NtSPS2相对表达量显著高于茎和根的。

2.4茄尼醇含量

从表3可以看出，烟草植株不同器官总茄尼醇和游离态茄尼醇含量差异显著（P>0.05），二者均是叶>茎>根；叶和茎的游离态/总茄尼醇无显著差异（P<0.05），且均显著高于根（P>0.05）。叶中总茄尼醇和游离态茄尼醇含量分别是茎的25.6倍、27.0倍；根中总茄尼醇和游离态茄尼醇含量均为O。由此可见，叶中总茄尼醇和游离态茄尼醇含量显著高于茎和根的。

2.5叶绿素含量

从表4可以看出，烟草植株不同器官中的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b和总叶绿素差异显著（P>0.05），四者均是叶>茎>根。其中，叶中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b和总叶绿素分别是茎的26.8倍、14.1倍、1.88倍、21.9倍，根中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均为0。由此可见，叶中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b和总叶绿素含量显著高于茎和根的。

3.讨论

本研究克隆获得了普通烟草NtSPSl和NtSPS2基因序列，其开放读码框长度分别为1209、1206 bp，编码氨基酸数目分别为402、401个。NtSPSl和NtSPS2的DDxxD结构域数目均为2个，DDxxD结构域是异戊烯基焦磷酸合酶最典型的保守结构域，其参与协调二价金属离子和底物分子二磷酸基团的结合，对反应底物的定位起关键作用，确保SPS功能发挥。在线预测表明，NtSPSl和NtSPS2成熟蛋白均定位于叶绿体中，并参与茄尼醇的生物合成，这与番茄SPS定位于叶绿体中相一致。构建系统进化树可以分析分子之间的亲缘关系，通常位于同一亚家族或小分枝上的分子往往可能具有相似的功能。本研究中，系统进化分析表明，NtSPSl和NtSPS2与番茄中的SPS亲缘关系最近，这与烟草、番茄均为茄科作物有关；然而NtSPSl和NtSPS2与番茄中的GPS同源性较低，这与SPS、GPS具有不同的生物催化功能有关，其分别用于催化合成C45茄尼基焦磷酸和C10栊牛儿基焦磷酸。表达特性分析表明，叶中NtSPSl和NtSPS2的相对表达量显著高于茎和根的，这与茄尼醇在叶中含量最高相一致。叶中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量显著高于茎和根的，这与NtSPSl和NtSPS2的相对表达量在叶中最高一致，可能与叶绿体是茄尼醇生物合成的场所有关。

本研究发现，NtSPSl和NtSPS2主要在叶中表达，这与拟南芥中两个SPS基因AtSPSl和AtSPS2主要在叶中表达相一致。水稻中，已经鉴定出两个SPS基因OsSPSl和OsSPS2，OsSPSl主要在根中表达，OsSPS2主要在根和叶中表达，并分别合成线粒体中的泛醌和叶绿体中的质体醌。最近研究发现，AtSPSl和AtSPS2基因沉默会降低拟南芥叶片中的质体醌含量并诱导产生PSII光抑制[24]，而fibrillin 5（FBN5）结合到AtSPSl和AtSPS2上调控质体醌合成；番茄SISPS组成型过表达可提高烟草幼嫩叶片中的质体醌含量，SISPS对番茄叶绿体结构和功能发挥是必须的。因此，目前对SPS功能的研究主要集中在质体醌生物合成中的作用，研究对象主要是拟南芥、水稻和番茄等模式植物，而SPS在茄尼醇生物合成中的作用研究很少，尤其在重要经济作物烟草中的研究未见报道。作为茄尼醇含量最丰富的植物资源，烟草茄尼醇合成调控仍不清楚，特别是NtSPS调控烟草茄尼醇生物合成的机制有待深入研究。本研究可为NtSPS调控烟草茄尼醇生物合成机制的深入研究奠定基础。

4.结论

本研究从普通烟草中克隆得到2个SPS基因，命名为NtSPSl和NtSPS2。NtSPSl和NtSPS2均存在两个保守的DDxxD结构域，其与NtSPS功能发挥相关；系统进化分析显示，NtSPSl和NtSPS2与番茄SPS同源性较高，这与烟草、番茄均为茄科作物有关；在线预测表明，NtSPSl、NtSPS2均定位于叶绿体中；烟草植株不同器官NtSPSl和NtSPS2表达水平排序为：叶>茎>根，这与茄尼醇、叶绿素在烟草植株中的分布规律一致。