骨组织工程中脐带间充质干细胞的应用进展

[摘要] MSCs是具多向分化与自我复制能力的干细胞，能够分化成为多种类型的组织细胞。相比于骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞，MSCs成本较低、来源充足、对捐献者不构成病毒或细菌感染，在未来的临床应用中展现了较好的发展与应用潜力。该文对骨组织工程中脐带间充质干细胞的应用进展进行分析。

[关键词] 骨组织工程；脐带；间充质干细胞

[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）10（c）-0195-02

骨折及骨科疾病是临床中较为常见的病症，为患者带来了一定身体痛苦与经济负担。目前临床中针对骨折与骨科疾病的治疗，主要采用自体移植、人工植入及异体移植等，但上述方式均存在一定缺陷。MSCs具强大的多向分化功能，能够诱导分化成骨细胞，帮助提升骨折或骨科疾病的治疗效果。在此背景下，对骨组织工程中脐带间充质干细胞的应用进展进行分析具一定现实意义。

1 MSCs的分离与培养

1.1 MSCs的分离

吉林大学生物医学工程学院的杨晨[1]对MSCs的分离进行了研究，首先在手术室收集得到足月分娩的、健康的、新鲜的胎儿脐带，将其放于融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中，在实验室内对脐带进行间充质干细胞分离。其次，将脐带取出，浸泡于酒精内约5 min，后以碘酒进行充分擦拭消毒，置于氯化钠溶液下反复清洗，直至外围血块完全冲掉。将脐带剪至2 cm/段的大小，以镊子固定住脐带边缘，用剪刀小心剔除脐带外膜，将内含的华氏胶组织分离出来。取胶完成后接着剔除脐带内的血管，再次以氯化钠溶液冲洗，或直接在融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中进行，以保证操作的无菌性。

1.2 MSCs的培养

武汉大学中南医院的胡培[2]等人对MSCs的分离、培养进行了研究，其MSCs分离操作与杨晨基本相同，华氏胶组织成功分离后，将其放入α-MEM培养液（内涵100 U/mL链霉素与青霉素、10%胎牛血清）中，在CO2浓度为5%、箱内温度为37℃的培养箱内进行培养，根据细胞生长情况，以0.25%胰蛋白酶进行传代培养。北京协和医学院的李铎[3]选择将切成管状的脐带继续切片，再将片状脐带组织切割致2～3 mm3，利用吸管逐一将碎状脐带组织植入T75培养瓶中，培养瓶已预先由D/F12培养基（内含有浓度为20%的FBS）包被完成，植入密度为每瓶20～25块碎状脐带组织；再将培养瓶置于温度为37℃，CO2浓度为5%的温箱中，定时向箱内补充培养基（1 mL/d），每隔3 d全量换液。

哈尔滨第五医院手外科分院的聂广辰[4]等人对脐带间充质干细胞生长曲线的绘制进行了研究，在细胞传代培养至第3代时将其分别种植于6孔板的其中4孔中持续培养8 d，按MTT法对细胞的增值情况进行测定，当细胞增值密度饱和，细胞进入平顶期时停测。卓峰等人[5]在细胞增殖特定于曲线绘制的研究中提出，现阶段培养MSCs普遍采用的方法包括酶消化法与培养法，对MSCs细胞进行初代培养，该过程消耗约2 w，当细胞融合率致80%时开始传代培养，在细胞种植2～4 d时增殖趋势最盛，传至第15代时增殖速度开始减慢，至20代时增殖基本结束。早期的细胞增殖的潜伏期在植入后的36 h内，之后开始了成对增长（5～6 d），增殖密度达到饱和后进入到平顶期，综上可知细胞增殖曲线呈“S”型。

2 MSCs的特征

2.1 细胞形态与生长特征

第二军医大学的胡凯猛[6]在显微镜下对MSCs的形态进行观察，按贴块法获取初代细胞后对其进行种植，4～5 d后即可在贴块下方观察到沿瓶底生长的hUMSCs，种植7 d后能够观察到细胞数量不断增多，主要呈小梭形及小三角形，继续培养细胞渐成集落状生长，且生长状态较为均衡，边界清晰，伴有生长晕。酶消化法培养下初代细胞生长速度较培养法快，通常2～3 d后即在瓶底出现细胞，7 d后由小梭形及小三角形变为多角形、纺锤形，且生长迅速，集落生长呈紧靠型。14～15 d后达到约85%的融合。MSCs胞浆较少，小梭形的形态较为显著，细胞核周的颗粒物质较少，消化传代完成后细胞解除集落样生长，且分布均匀。

2.2 细胞免疫学特征

吕鹏飞等人[7]在关于细胞免疫学特征的研究中提出，MSCs的免疫学优势显著，主要表现在其可以脱离免疫抑制作用而冲破MHC屏障，将细胞植入远交动物体内。在UCMSC的免疫学特征分析中，证实其对人外周血单核细胞、鼠脾细胞及纯化T细胞等免疫细胞具有抑制作用，从而减缓其增殖速度。毛希宏[8]的相关研究证明MSCs表面的抗原存在非专一性，主要包括细胞因子与生长因子受体类、粘附分子类、整和素家族成员类与其他分子类等四大类，实验结果表明UCMSCs中，CD29、CD73、CD44、CD13、CD105的阳性率超过90%，而CD134、CD45、CD11b则为阴性，在23代内的传代培养中，各类细胞因子无明显差异，证明UCMSCs在经过多代培养之后免疫学性质较为稳定。

2.3 细胞的诱导分化特征

hUCMSC的诱导分化能力较强，能够实现多向分化，包括内胚层、中胚层与外胚层。在张亚斌等人[9]的细胞诱导分化体内研究中，证实hUCMSC能够分化成为内皮细胞、心肌细胞、骨骼细胞、多巴胺能神经元细胞、神经细胞等，而在细胞诱导分化体外研究中，还发现hUCMSC可分化为成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、胰岛样细胞、生殖细胞、平滑肌细胞等，在研究hUCMSC分化成为成骨细胞时，发现在诱导过程中hUCMSC的ALP活性提升，且钙结节与钙沉积现象明显，证明其具成骨细胞的诱导潜能。上述研究结果表明，hUCMSC诱导分化功能强大，在临床中的应用价值与应用范围明显优于造血干细胞。

3 讨论

骨组织工程是近年来临床新兴的学科，其中胚胎干细胞作为骨组织工程研究的热点与重点，受到了临床医学界的广泛关注。通过上述研究可知，MSCs分化潜能较高，在软骨、成骨、韧带、肌腱、肌肉、神经、心肌、肝等组织中均具诱导分化潜能，临床应用前景广阔。李素萍等人[10]相关研究发现，在标准的细胞培养环境下，MSCs能够沿培养瓶进行增值，可以表达CD44、CD105及CD90，但不能表达HLA-DR、CD34及CD45，在体外培养时表现出成骨细胞的诱导分化潜能。

在此背景下通过改进现有MSCs诱导分化为成骨或软成骨细胞的培养方式，或在已知干细胞的基础上找寻新型干细胞，以提升胚胎细胞在骨组织工程研究中的合适度，成为目前国内外相关研究的探索目标。在现代生物科技快速发展的时代背景下，学者们一定可以寻找到理想的培养途径或干细胞类型，不断推动骨组织工程的发展前进。

[参考文献]

[1] 杨晨.脐带间充质干细胞的分离鉴定[D].长春：吉林大学，2013：9-11.

[2] 胡培.人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定[J].生物技术通讯，2014，25（1）：87-90.

[3] 李铎.人脐带间充质干细胞分离培养方法的研究[D].北京：北京协和医学院，2011：14-22.

[4] 聂广辰.人脐带间充质干细胞生物学特性及向成骨细胞分化的研究[J].中国伤残医学，2014，22（6）：48-52.

[5] 卓锋.人脐带间充质干细胞应用研究进展[J].中国矫形外科杂志，2012，20（1）：49-51.

[6] 胡凯猛.人脐带间充质干细胞向造血细胞方向分化的研究[D].上海：第二军医大学，2012：21-23.

[7] 吕鹏飞，张光武.脐带间充质干细胞在骨组织工程中的研究进展[J].中华临床医师杂志：电子版，2013，7（10）：4433-4435.

[8] 毛希宏.人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究[J].昆明医学院学报，2011，32（1）：41-47.

[9] 张亚斌，解莉楠.人脐带间充质干细胞研究进展及应用前景[J].生物技术通讯，2013，24（3）：437-438.

[10] 李素萍.人脐带间充质干细胞低温冻存后生物学鉴定[J].临床输血与检验，2012，14（4）：289-294.

（收稿日期：2014-08-16）