马铃薯卷叶病毒PLRV,RT,LAMP检测方法优化

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摘要 ：马铃薯卷叶病毒Potato leafroll virus （PLRV）是目前嚴重影响马铃薯产量与品质的主要病毒之一，给马铃薯产业造成巨大损失。本研究采用环介导等温核酸扩增（loop mediated isothermal amplification， LAMP）技术建立PLRV的RT LAMP检测方法。采取单因素变化试验，对RT LAMP反应体系中多个因素包括引物组合、温度条件及Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR Green Ⅰ和引物组合的浓度进行一系列试验和优化。采用RT PCR检测方法进行平行比对试验，对优化后的RT LAMP反应体系进行了验证。结果表明，最佳引物组合为P3，最适反应温度62℃，25 μL反应体系中，Mg2+、betaine、Bst 3.0 DNA聚合酶和UNG的最佳终浓度分别为4 mmol/L、0 mmol/L、0.64 U/μL和0.08 U/μL，dNTPs的最佳用量为1 μL（dATP、dGTP、dCTP各0.4 mmol/L，dUTP 1.2 mmol/L），SYBR Green Ⅰ（20×）的最佳用量1 μL，primer mix的最佳用量2.5 μL（PLRV FIP/BIP、PLRV F3/B3和PLRV LF/LB的浓度分别为0.8、0.2 μmol/L和0.6 μmol/L），RNA模板1 μL（2 ng/μL），加DEPC H2O至25 μL，反应时间50 min。优化后的RT LAMP检测结果与RT PCR一致，且可视化判读结果。因此，建立的PLRV RT LAMP检测方法为进一步开发RT LAMP检测试剂盒及其实际应用奠定了基础。

关键词 ：马铃薯卷叶病毒（PLRV）; 反转录环介导等温扩增（RT LAMP）; 检测方法

中图分类号：

S 435.32

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018484

Optimization of the PLRV RT LAMP detection method

GAO Yanping1，3， ZHANG Wu1，3， WANG Guoxiang2， XI Chunyan1， WU Yanbin1，3， LIANG Hongjie1，3， L Heping1，3

（1. Potato Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China; 2. Institute of Chinese Herbal

Medicines， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China; 3. Gansu Engineering Technology

Research Center of Potato Seed （Seedling） Virus Detection and Evaluation， Lanzhou 730070， China）

Abstract

Potato leafroll virus （PLRV） is currently one of the main threats for the yield and quality of potatoes， having caused tremendous damages to the potato industry. In this study， a PLRV reverse transcription loop mediated isothermal amplification （RT LAMP） method was established based on the loop mediated isothermal amplification （LAMP）. Single factor experiments were conducted to test and optimize the RT LAMP reaction system， including the primers， temperature， Mg2+， betaine， Bst 3.0 DNA polymerase， dNTPs， UNG， SYBR Green Ⅰ and primer mix concentrations. The optimized RT LAMP reaction system was then verified through parallel controlled test using the reverse transcription polymerase chain reaction （RT PCR） method. The results showed that， in the optimized reaction conditions， the primer pair was P3 and the reaction temperature was 62℃; in the 25 μL reaction system， the concentrations of Mg2+， betaine Bst 3.0 DNA polymerase， and UNG were 4 mmol/L， 0 mmol/L， 0.64 U/μL， and 0.08 U/μL， respectively; the dosage for dNTPs was 1 μL （0.4 mmol/L for dATP， dGTP， and dCTP， respectively， and 1.2 mmol/L for dUTP）; the dosage for SYBR Green Ⅰ（20×） was 1 μL; the dosage for the primer mix was 2.5 μL （the corresponding concentrations for PLRV FIP/BIP， PLRV F3/B3， and PLRV LF/LB was 0.8 μmol/L， 0.2 μmol/L， and 0.6 μmol/L， respectively）; for the 1 μL RNA template （2 ng/μL）， additional DEPC H2O was added to get a final 25 μL volume， and the reaction time was 50 min. The optimized RT LAMP provided the same detection result as RT PCR and the interpretation could be visualized. These results confirmed that our PLRV RT LAMP reaction system provides a basis for further developing RT LAMP detection kits and for their practical application.