斑玉蕈热激蛋白基因hsp70在刺芹侧耳中的转化

材料与方法

1.1 供试菌种与质粒

刺芹侧耳（Pleurotus eryngii）菌株QFl7111108026、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a、质粒pCAMBIAl301由青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室（以下简称“本实验室”）保存，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（Rif^r）菌株由美国国立卫生研究院提供。重组质粒PHspHyg由本实验室构建（图1），以质粒pROK2为二元载体，含有潮霉素B（hygromycin-R）筛选标记和斑玉蕈（Hypsizygusmarmoreus）热激蛋白基因（hsp70）。

1.2 试剂

限制性内切酶IPn I，Xba I，Nhe I，HindⅢ，Xho I，EcoR I购自美国Promega公司，卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、青霉素钠（Amp）、乙酰丁香酮（AS）、潮霉素（Hyg）、DNA凝胶回收试剂盒EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit（BBI）等购自上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

PCR引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成，其中引物

KPI（5′-GGGGTACCTTGCGACTAACAAATATGCT-3′），KP2（5′-TGCTCTAGACTCTATTCCCT-ACCATCATGTTC-3′）可特异扩增hsp70基因约2300 bp的基因片段；引物Hyg1（5′-GAAG-ATGTTGGCGACCTCGTATT-3′），Hyg2（5’-GACGCACAATCCCACTATCCTTC-3′）可扩增一段约840 bp含潮霉素基因的序列。

1.3 重组质粒转化农杆菌

参考SAMBROOK的方法，将测序正确的表达载体PHspHyg通过冻融法转化农杆菌菌株EHA105，用斑玉蕈热激蛋白hsp70基因的上下游引物KPl和KP2进行PCR扩增，并用酶切做进一步验证，经鉴定所得到阳性单菌落即为含目的基因的转化菌株。

1.4 潮霉素抗性试验

用打孔器切取活化的刺芹侧耳菌饼，分别接种至含Hyg浓度为0、40、50、60和70μg/mL的PDA平板上，于25℃进行暗培养，一周后观察刺芹侧耳菌丝对潮霉素的敏感性，以确定筛选抗性转化体的最适Hyg浓度。

1.5 转化试验

1.5.1 侵染时间优化

参考CHENEa3～的方法，挑取经抗性筛选、PCR检测为阳性的农杆菌单菌落，接种至100 mL（含有50μg/mL Kan和50μg/mL Rif）YEB培养基（g/L，5牛肉浸膏，1酵母膏，5蛋白胨，5蔗糖，4 MgSO₄·7H₂O）中，27℃过夜培养，然后8500 g离心10 min收集菌体，用含200 μmol/L AS的MM基本培养基E14]重悬，至OD600约为0.5，然后室温下以100 r/min振荡培养3～6 h以诱导vir区表达。

将刺芹侧耳液体菌种1 mL接种至装有100 mL PD培养基的250 mL三角瓶中，25℃下200 r/min振荡培养7 d，然后将菌丝球切割成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，无菌滤纸移去多余的培养基，再浸入重悬的农杆菌菌液中，于25℃下继续振荡侵染，时间设为30、60、90、120和150 min，每个处理设3个重复。侵染完成后将菌丝块吸干，转入PDA固体培养基上进行共培养，共培养时间为2 d。

将共培养后的平板在无菌条件下覆盖一层含400μg/mL Amp和60μg/mL Hyg的PDA培养基（约5 mm厚），继续培养5～10 d，初筛抗性转化子。将初筛生成的抗性转化子转入含青霉素400μg/mL和潮霉素70μg/mL的PDA复筛培养基上进行复筛，计算抗性转化率（潮霉素选择培养基上再生克隆组织块的百分比）。

1.5.2 AS浓度筛选

AS浓度设为100，200和300μmol/L，振荡侵染时间采用1.5.1试验优化的时间，其他试验条件和操作同1.5.1。

1.5.3 共培养时间优化

共培养时间设0、2和4 d，振荡侵染时间采用1.5.1试验优化的时间，AS浓度为1.5.2试验筛选出的浓度，其他试验条件和操作同1.5.1。

1.6 抗性转化子的PCR验证

挑取复筛培养基上生长健壮的抗性菌丝，分别扩大培养。CTAB法提取刺芹侧耳抗性转化子的基因组DNA，以Hygl和Hyg2为引物对其进行PCR扩增，并分别用质粒和非转化刺芹侧耳基因组DNA作阳性对照和阴性对照。反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，扩增30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 表达载体的PCR验证

构建的表达载体转化农杆菌EHA105的DNA PCR扩增得到与质粒阳性对照大小相同（约为2300 bp）的条带，说明质粒PHspHyg已经成功转入农杆菌中。

2.2 抗性试验潮霉素浓度

当培养基中加入Hyg浓度为40μg/mL时，刺芹侧耳菌丝生长即受到抑制，50μg/mL时菌丝停止生长，浓度继续升高达到60μg/mL时，刺芹侧耳菌丝已完全不能生长，因此将刺芹侧耳抗性转化子对潮霉素的最终筛选浓度设为70μg/mL。

2.3 刺芹侧耳遗传转化条件的优化

AS添加浓度可能影响插入拷贝数和转化效率。刺芹侧耳菌丝经添加200 μmol/L AS诱导剂的农杆菌菌液侵染后，其抗性转化率最高，如图2-A所示。因此选择AS添加浓度为200μmol/L。

转化过程中的农杆菌侵染时间对转化率也有较大影响，由图2-B可知，刺芹侧耳抗性转化率在农杆菌菌液侵染90 min时达最大，侵染时间继续延长后，抗性转化率开始降低，污染率也有不同程度的增加。

共培养时间过长容易导致农杆菌过度增殖，难以抑制，而共培养时间过短则可能使农杆菌的T-DNA转移不充分，降低转化率。不经共培养的刺芹侧耳菌丝在较大的潮霉素选择压力下几乎不能再生，共培养2 d的菌丝抗性再生率最高，共培养4 d的刺芹侧耳菌丝则多因农杆菌过度生长而难以存活（图2-C）。

2.4 抗性转化子的PCR验证

由图3可以看出，抗性菌株成功扩增出与阳性对照大小一样的条带，约为840 bp，而阴性对照在相应的位置并没有出现条带，结果说明刺芹侧耳转化子中已含有潮霉素片段，即PHspHyg质粒已成功导入刺芹侧耳中。

3 讨论

根癌农杆菌介导的食用菌遗传转化技术因其受体多样，操作简单以及转化效率高等特性越来越受到研究者的重视，其中农杆菌菌株类型、受体组织、启动子、选择标记、vir区基因诱导及共培养条件等是影响转化效率的关键因素。

本试验研究结果表明，菌液添加200 μmol/L乙酰丁香酮，共培养2 d时获得的具潮霉素抗性的转化子数最多。有文献报道农杆菌侵染时间过长可能对植物受体组织产生损伤，喻义赣在构建香菇（Lentinula edodes）遗传转化系统时发现农杆菌侵染时间在30 min内对转化率的影响无差异，本研究中以农杆菌侵染90 min的抗性再生率最高，这可能与菌种有关，还需进一步验证。食用菌的热激蛋白可能具有与植物相似的功能，这方面的研究也将是后续研究的方向。