乙草胺对大鼠肝细胞G蛋白偶联受体介导的胞浆钙离子振荡的调控

摘要：以大鼠肝細胞为研究对象，研究乙草胺对大鼠肝细胞G蛋白偶联受体介导胞浆钙振荡的调控。结果表明，单独乙草胺刺激不引发胞浆钙离子振荡，乙草胺和PE同时作用对肾上腺素能受体有抑制作用且具有明显的量效反应关系。

关键词：乙草胺;肾上腺素能受体;钙振荡;肝细胞

中图分类号：Q2;S482         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）16-0104-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.023           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The effects of different concentrations of acetochlor on the regulation of cytosolic calcium oscillation induced by G protein-coupled receptors in rat hepatocytes was investigated. The results showed that acetochlor and PE could inhibit PE receptors which the effect of acetochlor on it were dose-dependent， and acetochlor alone had no effect on PE receptors.

Key words： acetochlor;adrenergic receptor;calcium oscillations;hepatocytes

乙草胺（Acetochlor）是酰胺类中最具代表性的使用最多的3种除草剂之一[1]。乙草胺原药在中国的使用量已超过1×107 kg[2]。乙草胺通过渗透作用或雨水径流进入地下水和地表水，经富集作用，对水生生物或其他生物及人体的生理功能造成一定的损害。杨晓梅等[3]报道乙草胺对中华大蟾蜍早期胚胎发育具有明显的致畸致死效应。谢志浩等[4]发现乙草胺对泥鳅血红细胞微核及核异常的诱导率显著提高。生物肝细胞是最重要的排毒器官，其多种生理功能受到细胞表面的G蛋白偶联受体的调控，受体活性除受到其特异性配体的调控外，还受其周围微环境的影响。肝细胞多种生理功能受到细胞表面的G蛋白偶联受体（如α1肾上腺素能受体[5]、V1a血管加压素受体[6]、P2Y嘌呤能受体[7]）的调控[8]。Ca2+是细胞内普遍存在的第二信使，介导了细胞许多生命活动，如细胞收缩、分泌、运动等。大鼠肝细胞为非兴奋性细胞，Woods等[9]最先观察到苯肾上腺素（Phenylephrine，PE）诱导鼠肝细胞钙振荡，作用于肝细胞表面的α1肾上腺素能受体而调控肝细胞多种生理功能，其功能也受到胞浆钙的调控。而乙草胺对肝细胞的钙离子振荡影响机制目前尚未开展工作。因此，本试验旨在研究乙草胺对细胞钙离子振荡的影响机制，为进一步阐明乙草胺作用的分子机制提供试验依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物  大鼠：Sprague-Dawley雄性大鼠（200～400 g），购自中国人民解放军军事医学科学院动物房。

1.1.2  试剂  乙草胺购于Sigma公司;PE购于Sigma-Aldrich公司。

1.2  方法

1.2.1  大鼠肝细胞悬液的制备  参照Cui等[10]的方法，制备大鼠肝细胞悬液。每个灌流槽中加入10 μmol/L Fura-2-AM负载好的1 mL肝细胞悬液和1 mL标准液，静置30 min黏附。在正置荧光显微镜下，选择饱满、脂膜完整、胞核清晰的细胞进行圈定并测定。

1.2.2  乙草胺对大鼠肝细胞PE引发的胞浆钙离子振荡的调控  用340 nm和380 nm激发光交替照射细胞，在510 nm检测发射光，F340 nm/F380 nm比值反映胞浆钙浓度变化。PE在大鼠肝细胞可诱导胞浆钙离子浓度的钙振荡性增加，引发钙振荡的PE浓度为1 μmol/L[11]。经多次预试验，确定乙草胺未引起大鼠肝细胞胞浆钙振荡发生变化的最高浓度和最高肝细胞全不死的浓度分别为0.1、10 μmol/L。以此浓度范围为标准，按等比数列设计3个浓度组（0.1、1、10 μmol/L乙草胺），另设一对照组（1 μmol/L PE），每组均至少做3次重复。试验先用PE刺激15 min，中间用乙草胺作用15 min，然后再用PE刺激15 min。或者连续用PE刺激45 min，中间加入乙草胺作用15 min，从而检测乙草胺对PE刺激作用的影响。所得数据用SigmaPlot软件作图，以时间为横坐标，以荧光比值F340 nm/F380 nm为纵坐标。数据均以平均值±标准差表示，并采用t检验，P<0.05为差异显著。

2  结果与分析

2.1  乙草胺单独刺激对胞浆钙振荡的影响

由图1可知，PE刺激大鼠肝细胞后，第一次Ca2+振荡波峰出现，清洗35 min后，再进行PE刺激，第二次Ca2+振荡波峰出现。细胞是正常的，并且其受PE刺激后可引发[Ca2+]振荡样升高。细胞用胞浆Ca2+探针Fura-2AM负载，激活剂用灌流的方法引入细胞。其中，PE为1 μmol/L，加入时间为灌流5 min→PE刺激15 min→清洗35 min→PE刺激15 min→灌流5 min。

圖2为灌流5 min→PE刺激15 min→清洗10 min→乙草胺刺激15 min→清洗10 min→PE刺激15 min→灌流5 min。其中，乙草胺刺激浓度分别为0.1、1、10 μmol/L。结果表明，当PE刺激被清洗掉后，乙草胺不能引发大鼠肝细胞钙振荡。

2.2  乙草胺和PE同时作用对PE引发的胞浆钙振荡的影响

图3为灌流5 min→PE刺激45 min→灌流5 min。结果表明，PE刺激期间，可持续引起Ca2+振荡。图4为PE单独刺激15 min后，在继续PE刺激的同时，分别加入0.100、1、10 μmol/L的乙草胺，两者共同作用细胞时间为15 min，然后再PE刺激15 min，最后灌流5 min。结果表明，当乙草胺浓度为0.1 μmol/L时，由PE引发的胞浆Ca2+振荡变化不大;当乙草胺浓度为1 μmol/L时，由PE引发的胞浆Ca2+振荡明显受到抑制;当乙草胺浓度为10 μmol/L时，由PE引发的胞浆Ca2+振荡完全受到阻断。

乙草胺浓度为0.1 μmol/L时，乙草胺给药时和给药前后比较，对PE引起的钙振荡影响不大。乙草胺的浓度增加到1 μmol/L时，钙振荡影响比较明显，由给药前PE在15 min引起钙峰频率为9次，减少到PE和乙草胺同时刺激15 min时的3次以及乙草胺给药后PE单独刺激的5次。继续增加乙草胺浓度到10 μmol/L时，由PE引起的钙峰完全被抑制。

3  小结与讨论

乙草胺本身不能引起钙峰的出现，乙草胺不能对未被PE激活的肾上腺素能受体起作用或者其不能结合到未激活的肾上腺素能受体上;但当乙草胺的浓度从0.1 μmol/L增加到1和10 μmol/L时，乙草胺给药前和给药后对PE引起的钙振荡抑制显著，说明乙草胺可能引起大鼠肝细胞膜上PE受体数目减少，也或者乙草胺使得部分受体结构发生改变，从而减少了PE与PE受体的结合而导致钙峰减少。当乙草胺和PE同时作用于大鼠肝细胞时，乙草胺对大鼠肝细胞的胞浆钙振荡调控具有抑制影响，尤其是乙草胺的浓度增加到1 μmol/L及以上时，这种抑制作用更加显著。本研究揭示了乙草胺对生物细胞生理功能影响的作用可能是由于对受体——激活剂亲和力的影响而介导的，推测可能是乙草胺结合到已激活的肾上腺素能受体上起作用，也或者是乙草胺阻断了PE与肾上腺素能受体的结合。

综上所述，乙草胺抑制PE介导的大鼠肝细胞胞浆钙振荡，初步探索了乙草胺对肝细胞作用的分子机制，乙草胺对生物细胞生理功能的影响和更深层次的作用机制有待于进一步的探讨。

参考文献：

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[2] 王律先.我国农药工业概况及发展趋势[J].农药，1999，38（10）：1-8.

[3] 杨晓梅，谭志军，苑  怡，等.乙草胺对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响[J].动物学报，2001，47（S1）：125-130.

[4] 谢志浩，黄剑峰，陈  国.除草剂乙草胺对泥鳅血红细胞微核及核异常的诱导[J].科技通报，2003，19（1）：77-82.

[5] BERRIE C P，COBBOLD P H.Both activators and inhibitors of protein kinase C promote the inhibition of phenylephrine-induced[Ca2+]i oscillations in single intact rat hepatocytes[J].Cell calcium，1995，18（3）：232-244.

[6] GREGORY R B，HUGHES R，RILEY A M，et al.Inositol trisphosphate analogues selective for types I and Ⅱ inositol trisphosphate receptors exert differential effects on vasopressin-stimulated Ca2+ inflow and Ca2+ release from intracellular stores in rat hepatocytes[J].Biochem J，2004，381（2）：519-526.

[7] DIXON C J，WOODS N M，WEBB T E，et al.Evidence that rat hepatocytes co-express functional P2Y1 and P2Y2 receptors[J].Br J Pharmacol，2000，129（4）：764-770.

[8] ROBB-GASPERS L D，THOMAS A P.Coordination of Ca2+ dignaling by intercellular propagation of Ca2+ waves in the intact liver[J].J Biol Chem，1995，270：8102-8107.

[9] WOODS N M，CUTHBERTSON K S，COBBOLD P H.Repetitive transient rises in cytoplasmic free calcium in hormone-stimulatied hepatocytes[J].Nature，1986，319：600-602.

[10] CUI Z J，GUO L L.Photodynamic modulation by victoria blue of phenylephrine-induced calcium oscillations in the freshly isolated rat hepatocytes[J].Photochem Photobiol Sci，2002，1：1001-1005.

[11] 牛方方.非透膜Cys/Met小分子氧化剂对大鼠肝细胞GPCR介导的胞浆钙振荡的调控[D].北京：北京师范大学，2010.