二陈汤对肺癌A549细胞中黏附分子—1和p38表达的影响

摘要：目的 研究二陈汤对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的肺癌A549细胞中细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和p38表达的影响。方法 实验分为空白对照组、二陈汤对照组、TNF-α诱导组、二陈汤干预组、p38阻滞组，并给予相应干预。采用TNF-α诱导肺癌A549细胞产生ICAM-1高表达，以二陈汤含药血清处理ICAM-1高表达的肺癌A549细胞，采用Western blot免疫印迹法测定p38蛋白表达，以PCR法测定ICAM-1 mRNA水平，对二陈汤处理前后的ICAM-1表达水平及p38蛋白表达进行分析。结果 二陈汤干预组肺癌A549细胞中血清ICAM-1表达及p38活性与TNF-α诱导组比较显著降低（P<0.01）。结论 在体外实验中，二陈汤有可能通过抑制p38的活性而实现对ICAM-1表达的调控，这可能为二陈汤控制肺癌转移的机制之一。

关键词：二陈汤；细胞间黏附分子-1；p38蛋白；肺癌A549细胞

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）08-0041-03

细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达在肺癌转移中起着重要的负向调节作用[1]。在包括肺癌、胃癌、肝癌、大肠癌等众多的肿瘤中，ICAM-1在肿瘤发生转移后都会明显升高，ICAM-1的表达与肿瘤的分期与预后有着密切的关系，ICAM-1的高表达提示了肿瘤的进展、转移及更差的预后，因此通过治疗，干预ICAM-1的表达，可能对肿瘤转移具有抑制作用。p38信号通路是介导真核细胞中的应激炎症反应的一个主要通道，同时p38信号通路也参与了肿瘤发生和发展的调节过程。p38信号通路能通过增强炎症细胞因子的表达而促进肿瘤细胞生长、肿瘤血管生成、肿瘤细胞迁移和浸润；p38作为丝裂原活化蛋白激酶家族成员可以调控ICAM-1的表达。因此，有效的控制肿瘤转移的方法可能对ICAM-1与p38表达产生影响。痰证是肺癌的重要证候，而化痰法是中医治疗肺癌的重要方法，二陈汤是经典的化痰方剂，在肺癌治疗中也发挥着重要的作用。我们通过体外实验，研究二陈汤是否能通过对p38信号通路的调节而干预ICAM-1的表达，以揭示二陈汤治疗肺癌的机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD大鼠，清洁级，体质量180～200 g，北京维通利华实验动物技术公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2002-0003。

1.2 二陈汤制备

按照《太平惠民和剂局方》中二陈汤的配伍比例：制半夏15 g，橘红15 g，茯苓9 g，甘草4.5 g，生姜7片，乌梅1个。参照2010年版《中华人民共和国药典》确定原药材产地，炮制方法，委托本院中药制剂室进行加工，并对pH值、比重、卫生学等进行检测。常温储藏，用前摇匀。

1.3 含药血清制备

健康雄性SD大鼠5只，使用二陈汤灌胃，给药剂量0.9 g/（kg·d）。每日2次，每次3 mL，连续10 d，于末次给药后1 h麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血，分离血清，56 ℃灭活30 min，分装冻存备用。另取雄性SD大鼠5只，以等体积生理盐水灌胃，所取血清作为对照使用。

1.4 A549细胞培养

将人肺癌细胞株A549（中国科学院细胞库）用DMEM培养基（含10%小牛血清、青霉素100 µg/L、链霉素100 µg/L），37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化，取对数生长期细胞进行实验。

1.5 分组与给药

将A549细胞分为5组。空白对照组：正常培养24 h；二陈汤对照组：使用二陈汤（20%）含药血清预先处理6 h；TNF-α诱导组：200 U/mL的TNF-α培养12 h；二陈汤干预组：使用20%二陈汤含药血清预先处理6 h，200 U/mL的TNF-α培养12 h；p38阻滞组：使用p38特异性阻滞剂SB203580（Promega， V1161，美国）预处理30 min后（浓度为25 mmol/L），加入200 U/mL的TNF-α培养12 h。

1.6 细胞间黏附分子-1 PCR检测

RNA提取按Trizol提取试剂盒（Invitrogen，美国）操作说明书进行，提取的RNA质量由A260/A280比值和1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。mRNA反转录为cDNA：按试剂盒说明分别加入MgCl2 2 µL、10 ×RT Buffer 1 µL、RNase Free H2O 3.75 µL、dNTP 1 µL、RNase 抑制剂0.25 µL、AMV 0.5 µL和下游引物0.5 µL（随机引物），混匀。每管分装9 µL，然后加RNA 1 µL，离心混匀。进行反转录，反应条件：42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。在ABI的GeneAmp 9600型PCR仪进行PCR反应，引物序列：ICAM-1（5’-CAGTCACCTATGGCAACGA-3’，5’-CTGAGACCTCTGGCTTCGT-3’），β-actin（5’-CCATCGTCCACCGCAAAT-3’，5’-GCTGTCACCT TCACCGTTC-3’）。按以下反应体系进行：5×PCR Buffer 10 µL、Taq酶0.25 µL、RNase Free H2O 29.75 µL和上下游引物各0.5 µL（ICAM-1、β-actin引物），混匀。每管总反应体系40 µL，加入上述各管中，进行PCR反应，反应条件：94 ℃变性2 min后，94 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、45 s，共30个循环，72 ℃延伸7 min。

1.7 Western blot免疫印迹法测定p38蛋白表达

按Western blot印迹方法测定p38，以磷酸化p38（p-p38）与p38蛋白（Santa Cruz Biotechnology，美国）表达量的比值作为p38蛋白活性的相对表达水平。Western blot具体操作步骤如下：配制15%分离胶，4%的浓缩胶，加入50 g蛋白的上样样品至0.5 mL离心管中，加入5×SDS上样缓冲液。上样前将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性，冷却至室温，加足量的电泳液后上样；电泳；转膜；封闭；将兔抗p-p38及p38单克隆抗体以1×TBST稀释（1∶2 000），4 ℃过夜；TBST洗2次，每次10 min；同上方法准备二抗稀释液并与膜接触（1∶1 000），室温孵育1 h，TBST在室温下脱色摇床上洗2次，每次10 min，进行化学发光，显影，定影；扫描胶片，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS12.0统计软件进行分析，实验数据以—x±s表示，采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞间黏附分子-1 mRNA表达水平检测

ICAM-1 mRNA反转录扩增片断长度为186 bp，内参为β-actin，长度为194 bp。各组ICAM-1反转录并扩增后电泳，空白对照组和二陈汤对照组电泳条带不明显，其余各组可见明显电泳条带。经方差分析，TNF-α诱导组ICAM-1显著高于正常对照组和二陈汤对照组（P<0.01）。使用二陈汤含药血清或SB203580处理后，ICAM-1表达显著下降（P<0.05）。见表1、图1。

2.2 p38蛋白表达检测

以p-p38与p38蛋白表达量的比值作为p38蛋白活性的相对表达水平。经方差分析，TNF-α诱导组p-p38显著高于正常对照组和二陈汤对照组（P<0.01）。使用20%二陈汤含药血清或SB203580处理后，p-p38表达显著下降（P<0.05）。见表1、图2。

3 讨论

原发性支气管肺癌治疗效果不理想，主要的原因是大多数肺癌患者在就诊时就已经发生了局部或广泛的转移[2]。而在肺癌的发展与转移中，ICAM-1发挥着重要的调节作用。由于ICAM-1与淋巴细胞功能相关抗原-1结合后可以阻断免疫效应细胞对靶细胞的有效识别，中断激活静止T淋巴细胞所必需的

信号，抑制NK细胞、LAK细胞的细胞毒性作用，从而打断机体对肿瘤的免疫监视、杀伤作用。随着可溶性ICAM-1（sICAM-1）不断进入血循环，就形成了一个肺癌细胞逃脱机体免疫系统攻击的防御环境；同时黏附分子使已入血的肺癌细胞得以黏附血管内皮细胞，造成血行转移，导致ICAM-1在肺癌转移的多阶段序贯过程中发挥了重要的负向调控作用。

ICAM-1的表达可以在细胞内的多个环节上受到调控，其中丝裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）在ICAM-1的调控上发挥了重要的作用[3]。其中，p38 MAPK做为细胞信号传递的交汇点，通过非磷酸化转化为磷酸化状态而促进下游底物的磷酸化以快速实现信号传递。脂多糖、TNF-α、白细胞介素-1等多种因素均可导致细胞内p38迅速活化，进而诱导ICAM-1表达等多种细胞反应[4]。因此，抑制p38磷酸化有可能有效抑制ICAM-1的表达。

肺癌转移是指肺癌原发灶或经治疗后残存的癌细胞经血管、淋巴管扩散到远隔部位形成新的同一类型的肿瘤。可见肺癌的转移需要两个条件：第一是扩散，第二是在新的部位停留。而痰的特性正好符合这两个条件，如《杂病源流犀烛》所云：“痰之为物，流动不测，故其为害，上至巅顶，下至涌泉，随气升降，周身内外皆到，五脏六腑俱有。”《丹溪心法》则云：“凡人身上、中、下有块者，一是痰。”我们前期的证候学研究显示，痰证是中晚期肺癌较为特异的证侯类型，其发生率在所有证候类型中居第一位[5]，因此，痰浊内阻是肺癌发生转移的一个重要病理基础和必要条件[6]。

临床上，使用化痰法干预肺癌术后复发、转移，部分患者可明显改善症状，延长带瘤生存时间，取得了较好的疗效[7]。二陈汤源于宋代《太平惠民和剂局方》，由法半夏、陈皮、茯苓、甘草组成，具有燥湿化痰、理气和中功效，为化痰名方。在肺癌的治疗中，二陈汤也发挥着重要的作用。

在本实验中，我们可以看到，TNF-α可诱导A549细胞ICAM-1高表达，与空白对照组及二陈汤对照组比较，TNF-α组ICAM-1增高非常显著，而二陈汤干预组可以显著抑制TNF-α诱导ICAM-1高表达，说明二陈汤具有抑制肺癌ICAM-1表达的作用，其治疗肺癌的作用应该与此有关。本实验中，TNF-α在增高ICAM-1的同时，可增高p38活性，而p38具有可上调ICAM-1的水平的作用，由实验结果可见，p38与ICAM-1的升高具有同步性，而二陈汤可以有效下调p38活性，结合二陈汤具有控制ICAM-1表达的作用，我们可以推测，二陈汤很可能是通过抑制p38磷酸化这一途径发挥抑制ICAM-1作用的。p38是介导应激炎症反应的重要通道，而二陈汤有可能是通过抑制应激炎症反应达到调节p38活性的作用，并进一步控制ICAM-1表达。而二陈汤在控制肿瘤进展、转移等方面发挥作用可能与其调控ICAM-1表达及p38活性有关。介于ICAM-1与p38与多种肿瘤进展密切相关，二陈汤对其他肿瘤中ICAM-1及p38活性有无相似作用，有必要做进一步研究。

参考文献：

[1] Hayes SH， Seigel GM. Immunoreactivity of ICAM-1 in human tumors， metastases and normal tissues[J]. Int J Clin Exp Pathol，2009， 2（6）：553-560.

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[3] Lin FS， Lin CC， Chien CS， et al. Involvement of p42/p44 MAPK， JNK， and NF-kappaB in IL-1beta-induced ICAM-1 expression in human pulmonary epithelial cells[J]. J Cell Physiol，2005，202（2）：464-473.

[4] Cheung PF， Wong CK， Ip WK， et al. IL-25 regulates the expression of adhesion molecules on eosinophils：Mechanism of eosinophilia in allergic inflammation[J]. Allergy，2006，61（7）：878-885.

[5] 王芬，胡凯文，陈文强，等.中晚期肺癌的中医聚类分型[J].中国中医药信息杂志，2006，13（10）：28-29.

[6] 胡小勤，陈利国.肺癌转移的痰瘀病机探讨[J].辽宁中医杂志，2006， 33（12）：1555-1556.

[7] 何秀兰，胡凯文，肖俐.王沛教授防治肺癌术后复发转移临床经验[J].中国中医基础医学杂志，2006，12（3）：222-224.

（收稿日期：2012-01-05，编辑：华强）