重组人胸腺肽α原在单一蛋白生产系统中的高效表达

材料与方法

1.1 质粒和菌株

pMzaF和pColdII（sp-4）購于宝生物工程（大连）有限公司。E. coli BL21（DE3）由笔者所在实验室保留。

1.2 试剂

胰蛋白胨、酵母粉购于Oxiod公司，质粒提取试剂盒（E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I）购于OMEGA公司，限制性内切酶购于宝生物工程（大连）有限公司；SYBRGreenⅠ购于Invitrogen公司，蛋白质分子量标准购于GE有限公司，10 kb GeneRuler DNA Ladder Mix购于Fermentas公司，其他化学试剂均购于北京化工厂。

1.3 主要仪器

DYY-5 型电泳仪（北京市六一电子仪器厂），Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪（美国 BIO-RAD 公司），HZQ-X100型恒温振荡培养箱（黑龙江哈尔滨东联电子技术开发公司），JY99-2D型超声波细胞破碎仪（浙江宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA质粒的构建

根据人源proTα的mRNA序列（GenBank：M14794.1）设计在SPP系统中表达的proTα基因序列，采用E. coli通用密码子将Tα原中的ACA碱基序列敲除并由上海海捷瑞生物科技有限公司合成pGH-proTα-lessACA质粒。将pGH-proTα-lessACA质粒与pColdⅡ （sp-4）质粒用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后凝胶回收目的基因与载体基因，再用T4 DNA连接酶进行连接。双酶切体系：pGH-proTα-lessACA与pColdⅡ（sp-4）10 μL，10×Buffer 2 μL，Nde Ⅰ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，H2O 6 μL，37 ℃温育4 h。连接体系：双酶切后的proTα-lessACA基因4.5 μL，双酶切后的pColdⅡ （sp-4）1.5 μL，H2O 1.5 μL，10×连接缓冲液1 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，16 ℃连接16 h后凝胶回收pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒。最后将pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒经CaCl2法转化至E. coli BL21（DE3）菌株中，再经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定和酶切鉴定。其表达的proTα的氨基酸序列为MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEE AENGRDAPANGNANEENGEQEADNEVDEEEEEGGEEEEEEEE GDGEEEDGDEDEEAESATGK。

1.4.2 proTα在SPP系统中的表达与鉴定

将pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA转入E. coli BL21（DE3）感受态细胞。经氨苄青霉素筛选后，再将pMzaF质粒转入已含有pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒的 E. coli BL21（DE3）感受态细胞，氯霉素筛选后获得共转细胞。采用冷休克表达方法。挑取阳性克隆，接种于5 mL LB培养基（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）中，37 ℃振荡培养至D600 nm为0.5左右，接种于100 mL LB（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）液体培养基中，37 ℃振荡培养至D600 nm为0.4左右，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），16 ℃诱导表达5 d。在表达0、8、16、24、48、72、96、120 h时，6 000 r/min离心 10 min 收集菌体，50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）缓冲液洗菌体后离心收集，加入4倍体积50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）缓冲液重悬超声后的破碎菌体，12 000 r/m离心30 min，上清用0.45 mm滤膜过滤，采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳鉴定Tα1的表达[10]。采用考马斯亮蓝法测蛋白表达量，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准[11]。

2 结果与分析

2.1 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒基因的设计

设计适于在SPP系统中表达的proTα基因序列，采用E. coli通用密码子将proTα中的ACA堿基序列全部敲除，其基因序列见图1。

2.2 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒的鉴定

构建的pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒经限制性内切酶Nde Ⅰ和HindⅢ单/双酶切后由1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果说明质粒构建成功（图2）。

2.3 proTα的冷休克表达与鉴定

共转化pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA质粒和pMazF质粒的E. coli BL21（DE3）受到IPTG诱导后开始表达Tα1。分别收集0、8、16、24、48、72、96、120 h的可溶性蛋白，理论上即为SPP系统表达的纯蛋白，Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果见图3。结果显示，在表达的第2天即可表达较纯的可溶性蛋白，说明Tα1可以在SPP系统成功表达。在诱导120 h后，在上清液中的可溶性蛋白的最终产率为16.27±0.94 mg/L（BSA标准曲线为 y=0.005 26x+0.070 03，r2=0.999 8）。人源性proTα的理论分子量为9.45 ku，而在SPP系统中所表达的proTα由于在其N端增加了转录增强元件（transcription enhancer element，TEE）和6×His标签共11个氨基酸，因此其理论分子量增加至10.97 ku。

3 结论

采用共转法建立的SPP表达系统能够在E. coli中正确高效表达proTα，其产量可达16 mg/L。通过SPP系统表达最终制备获得了大量的proTα，可以省去纯化蛋白的步骤，大大节省了纯化所需的人力、物力和时间。采用SPP系统表达的proTα经RP-HPLC分析，纯度可达97 %以上。采用SPP系统冷休克表达proTα工艺简单，整个过程约在1 周内完成，不需要纯化过程即可获得纯度较高的产品，为利用基因工程方法大量制备proTα提供了一种简便而又切实可行的方法。

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