CEACAM1异常表达对白血病BALL—1细胞增殖的影响

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摘 要：通过siRNA技术抑制癌胚抗原相关粘附分子CEACAM1在人急性B淋巴细胞白血病细胞系BALL-1中的表达，体外实验研究异常表达于白血病B细胞的CEACAM1对细胞增殖的影响。 应用CCK-8法测定细胞增殖发现CEACAM1表达下调后BALL_-1细胞的增殖能力明显下降。 细胞周期分析结果显示CEACAM1被抑制后细胞增殖状态表现为S期细胞百分比降低，G0/G1期细胞比例升高，提示CEACAM1表达下调是通过引起细胞周期停滞在G0/G1期来降低细胞增殖的，表明CEACAM1本身对自血病B细胞具有促进增殖的作用

关键词：CEACAM1：白血病B细胞：增殖

中图分类号：R34

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）06-0516-05

癌胚抗原相关粘附分子CEACAM家族包括CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5、CFACAM6.CEACAM8，隶属于免疫球蛋白超家族。CEA-CAM1，又名BGP或CD66a，是CEACAM家族的主要亚型之一，广泛分布于人体内多种组织。在血液系统中，除了CEACAM5只存在于卜皮细胞与血细胞系统无关外，CEACAM1与其他CEA -CAM成员都存在于髓细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞，尤其是成熟中性粒细胞。CEACAM1是白细胞表而的膜分化抗原之一，其作为粘附分子与细胞增殖，凋亡，侵袭，转移有关。正常血液中，CFACAM家族的表达只局限于髓细胞，淋巴细胞不表达CEACAM分子，但多位研究者却在急性B淋巴细胞白血病（B-急淋）病例中发现癌变的B淋巴细胞表面有CEACAM家族的表达，且分子亚型多为CEACAMl或CEACAM6。虽然CEACAMl异常表达于白血病B细胞的现象已广泛报道，但是这种异常表达对白血病B细胞造成的功能效应日前却罕有了解，因此本文以B-急淋白血病细胞系BALL-l为研究对象，通过小干扰RNA （siRNA）技术下调CEACAM1表达，探讨CEACAMl对白血病B细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人急性B淋巴细胞白血病细胞系BALL-1（Riken Cell Bank，日本）；DMEM培养基、胎牛血清（Hyclone，美国）；无血清培养基Opti-MFM （Iilvit-rogen，美国）；Trizol试剂 （Invitrogen，美国）；RT-PCR试剂盒与SYBR Green QRT-PCR试剂盒（Takara，日本）；FITC标记的小鼠抗人pan-CFA-CAM单抗及小鼠IgG抗体（BD Pharmingen，美国）；兔抗人pan-CEACAM多抗、小鼠β-actin单抗（Santa Cruz，美国）；HRP标记的羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗（武汉博上德公司）；膜蛋白提取试剂盒（南京凯基公司）；ECL试剂盒（Thermo Scientific，美国）；CCK-8试剂盒及细胞周期检测试剂盒（上海碧云生物公司）；电转杯（BIO-RAD，美国）；电穿孔仪ECM 830（BTX.美国）；PCR引物均山Takara公司合成；CEACAMl-siRNA和阴性对照SiRNA由苏州吉玛基因公司设计并合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BALL-1细胞加入含10%胎牛血清的DMEM培养基并放置于CO2培养箱中进行培养，条件为37℃、5% CO2、饱和湿度。

1.2.2 流式细胞仪检测CFACAM表达

5xl0 5 BALL-1细胞用PBS溶液清洗3次后，重悬于80μL PBS 并加入20μL FITC标记的pan-CEACAM 单抗置4 ℃避光孵育30 min，然后用PBS溶液清洗3次，重悬于500μL PBS溶液，应用流式细胞仪及CeIIQuest软件进行检测分析。同型IgG阴性对照用于评估背景荧光强度。

1.2.3 RT-PCR检测CEACAM亚型

Trizol法提取细胞RNA，逆转录后做PCR扩增。引物如下：CEACAMl， 5"-ACAGCAGCCGTGCTCGAAGC-3’和5’-TGGACAGCTGCAGC-CTGCGA-3’（产物659 bp）；CEACAM3，5’-TCT-AAACTTCTGGAACCCGCC-3’和5’-TCCAGTT -TTGGCAAGGAGCAG-3"（ 产物469 bp）；CEA -CAM6，5’-GCTCTGATATAGCAGCCCTGGTG-3’和5’-CTTCAGGAGCAGAGCAGACCTG-3’（产物141 bp）； CEACAM8， 5"-CTGACAGCCGTGCT-CAGAAAC -3’和 5’-CAGTTGTAGCCACGAG-GGTC -3’ （产物275 bp）；内参β-actin，5’-TG-GCACCCAGCACAATGAA-3’和 5’-CTAAGTCA-TAGTCCGCCTAGAAGCA-3’（产物186 bp） 。 扩增条件：94 ℃预热5min，94℃变性30s，60℃复性40 s.72℃延伸1 min， 30个循环，72 ℃延伸5min取扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察结果。

1.2.4

siRNA电穿孔转染沉默CEACAM1基因

2xl0 6 BALL-1细胞用无血清培养基Opti-MEM清洗并重悬，200 μL细胞悬液中加入5μgSiRNA置于电转间距为0.4 cm的电转杯中，应有电穿孔仪在电压340 V，电击时间4 ms条件下进行电穿孔转染。电转后加入完个培养基在CO2培养箱中继续培养。所用siRNA序列如下：siCEA -CAM1，正义链5’-GACCCACCUAACAAGAUGA-TT -3"和反义链5"-UCAUCUUGUUAGGUGGG-UCTT-3’；阴性对照sicontrol，正义链5’-UUCUC-CGAACGUGUCACGUTT-3’和反义链5’-ACGU-GACACGUUCGGAGAATT-3’未加任何siRNA的电穿孔细胞作为空白对照。

1.2.5 实时定量PCR检测（quantitative real timePCR. QRT-PCR）

转染36 h后，为检测CEACAM1基因沉默结果，提取各组电穿孔细胞RNA，反转录后进行QRT-PCR，采用△△CT法计算，比较各组细胞mRNA变化扩增条件：95℃预热30s，95℃变性5 s，60 ℃复性20s，40个循环CEACAM1引物如下：5’-GACCACTCCAATGACCCACC-3’和5’-GGGAGGCTGAAGTTGGTTGT-3’。β-actin作为内参基因（引物同上）。每组细胞均设3个复孔，结果取平均值。

1.2.6

WeSten-blot检测CEACAM1蛋白表达

转染48 h后，为检测CEACAMl蛋白表达下调结果，提取各组电穿孔细胞膜蛋白。蛋白定量后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将分离的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上。封闭，洗膜，与一抗、二抗孵育，用ECL化学发光试剂显色成像。一抗分别为兔抗人pan-CEACAM多抗、小鼠β-actin单抗，二抗为羊抗兔二抗及羊抗鼠二抗。

1.2.7 CCK-8法测定细胞增殖

为检测CEACAM1抑制后对白血病B细胞增殖的影响，分别在转染后12、24、36、48 h用CCK-8法测定细胞增殖情况。将各组电穿孔细胞加入96孔板中（3 000个/孔），同时设仅含有D1VIEM培养液的空白孔用于调零，每组均设5个复孔：每孔加入l0μL CCK-8溶液，在细胞培养箱孵育2 h.用酶联免疫检测仪于450 nm测吸光值，结果取5孔平均值。

1.2.8流式细胞仪分析细胞周期

转染48 h后，各组细胞用PBS清洗后，以70%乙醇固定，4 ℃过夜。然后再次用PBS清洗3次，加入500μL细胞周期检测试剂盒里的反应液及10μg/mL碘化丙啶（PD，37 ℃避光孵育30 min，应用流式细胞仪和Modfit LT软件分析染色细胞。

1.2.9统计分析

两组变量之问差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CEACAM1在BALL-1细胞膜上的表达及亚型分析

流式细胞仪检测结果显示BALL-l细胞表而呈CEACAM抗原阳性表达（图1A）。因所用的流式抗体pan -CEACAM可识别CEACAM1等多个CFACAM家族成员，所以本实验分别设计了CEACAM1、3、6、8 四种亚型的引物用于RT-PCR扩增，在核酸水平上检测BALL-l细胞所表达的CEACAM抗原是何种亚型。电泳结果显示RALL-1细胞只表达CEACAMl （图1B）。

2.2 转染细胞中CEACAM1表达下调的检测

经电穿孔技术将CEACAM1 siRNA转染到BALL-1细胞后，应用QRT-PCR方法在核酸水平上检测CEACAMl基因沉默效果。结果显示阴性对照组（sicontrol）与空白对照组（mock）无统计学差异，而siCEACAMl组的CEACAMl mRNA水平与阴性对照组相比下降近5倍（图2A）。另外，应用Western-blot方法在蛋白水平上也证实了siCEACAM1组中的CEACAMl表达水平明显下降（图2B）。

2.3 CEACAM1表达下调对BALL-1细胞增殖的影响

应用CCK-8法检测转染后BALL-1细胞的增殖能力，图3结果显示siCEACAMl组细胞增殖能力明显低于阴性对照组（P<0.05）.而空白对照组（mock）与阴性对照组相比无统计学差异（P>0.05）。

2.4 细胞周期分析

应用流式细胞仪检测转染后细胞周期，观察CEACAMI抑制后对BALL-1细胞周期的影响。在细胞周期分析图中，第一峰代表G0/G1期细胞，第二峰代表G2/M期细胞，S期细胞介于两峰之间。图4结果显示siCEACAMI组的S期细胞百分比从34.35%（阴性对照组）降至19.22%，且G0/G1期细胞比例增加（P0.05），阴性对照组与空白对照组无统计学差异，提示CFACAM1表达下凋后抑制细胞从G0 /G1期进入S期，从而引起增殖下降。

3 讨论

白血病细胞与正常白细胞相比往往呈现蛋白表达谱的改变，最常见的就是白血病细胞膜上分化抗原的改变，如原本表达于髓细胞的CEACAM家族就足异常表达于B-急淋白血病细胞上的抗原分子，CEACAM1是其中主要亚型。由于白血病主要是分化不成熟的异常白细胞因增殖失控而大量累积，导致正常造血受抑制的恶性克隆性疾病，因此本实验的工作目标着重于研究CEACAM1异常表达对白血病B细胞增殖的影响。

通过流式细胞仪和RT—PCR检测，证明急性B淋巴性白血病细胞株BALL-1只表达CEACAM家族里的CEACAMl，因此本实验选取BALL-l进行CEACAM1的研究。CEACAM1主要的生物学功能是通过同嗜性相瓦作用介导细胞粘连，也可以通过异嗜性相互作用与细胞外基质结合，还可以作为效应因子参与信号转导通路，从而参与调节细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移。本研究应用siRNA技术抑制CEACAM1表达会导致其同嗜性结合的减少，削弱细胞间CEACAMl-CEA-CAM1相互作用，从而改变CEACAM1对白血病B细胞的影响。本研究通过对转染细胞的增殖检测发现CEACAM1表达下调后BALL-1细胞的增殖能力明显下降，且根据细胞周期分析结果可见其增殖状态表现为S期细胞百分比的降低并伴随G0/Gl期的细胞聚集，C2/M期细胞数则基本没有变化，意味着CEACAM1被抑制后是通过引起细胞周期停滞在G0/G1期来降低细胞增殖的，表明CEACAMl本身对白血病B细胞具有促进增殖的作用。该结果与国外一些学者的报道一致，他们发现在某些癌症中如甲状腺癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤等CEACAM1表达上调，导致肿瘤进行性生长，并与转移和预后不良高度相关。最新报道也揭示了CEACAM1异常表达对白血病B细胞有促进增殖及抑制凋亡的作用，这些作用与CEACAMl-L和CEACAM-S两个变异体之间的表达比例有关。本文则研究了CEACAM1异常表达对于细胞周期的影响，发现抑制CEACAM1可以引发白血病B细胞周期停滞。

综上所述.本研究确立了CEACAM1对B-急淋白血病细胞的促增殖作用及对细胞周期的影响，但其分子机制尚不清楚。深入分析CEACAM1对白血病细胞增殖的调控机制及其异常表达于B-急淋白血病的发生机制，有助于拓展对B-急淋的认识并能为B-急淋的治疗提供潜在靶点。