BRMS1、整合素β1及p—AKT在卵巢癌组织中的表达及临床意义

[摘要] 目的 研究乳腺癌转移抑制因子1（BRMS1）、整合素β1、p-AKT在卵巢癌中的表达及其与临床病理特征的关系。 方法 应用免疫组织化学法检测卵巢癌、良性肿瘤及其卵巢组织中BRMS1、整合素β1、p-AKT的表达。结果BRMS1在卵巢癌中阳性表达率降低（P<0.01），其表达与卵巢癌转移相关，与组织学分级无关。整合素β1及p-AKT在卵巢癌中的阳性表达率升高（P<0.01），其表达与卵巢癌病理分期、分化程度有关（P<0.05）。BRMS1与整合素β1及p-AKT在卵巢癌组织中表达呈负相关（r=-0.59，r=-0.50，P<0.05）。 结论 卵巢癌中BRMS1有可能通过抑制整合素β1/AKT通路，抑制肿瘤转移。

[关键词] 乳腺癌转移抑制因子1；整合素β1；p-AKT；卵巢癌

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（b）-0009-03

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，70%的患者就诊时已经出现转移[1-2]。乳腺癌转移抑制基因1（breast cancer metastasis suppressor 1，BRMS1）是最近发现的一种新的转移抑制基因。其在卵巢癌组织中低表达。笔者前期体外试验证明，其具有抑制卵巢癌细胞侵袭、转移及黏附的功能，但缺乏体内及临床标本验证[3]。整合素不仅是黏附分子，也是一种信号转导分子，其能介导细胞内外双向信息传递，从而发挥其调节细胞生物学行为的功能，这种作用主要通过β亚基完成。整合素β1在卵巢癌组织及细胞株中高表达[4]，与患者的预后、组织分化呈负相关[5]。整合素β1/AKT信号通路在卵巢癌侵袭转移过程中起到重要作用，而BRMS1与整合素β1/AKT信号通路在卵巢癌中相关性的研究目前极少见到报道。研究BRMS1、整合素β1及p-AKT在卵巢癌组织中的表达，可以为了解卵巢癌的发生发展及BRMS1抑制肿瘤侵袭转移的机制提供一个新的切入点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

收集郑州大学第一附属医院医院妇科2008年1月～2012年12月，资料完整的46例卵巢癌石蜡标本，患者年龄24～76岁，中位年龄48岁，绝经前18例，绝经后28例。切片经常规HE染色，至少2位病理学专家独立诊断。按照FIGO分期标准分类：Ⅳ期4例，Ⅲ期25例，Ⅱ期9例，Ⅰ期8例；组织学类型：浆液性囊腺癌28例，低分化腺癌2例，子宫内膜样癌6例，黏液性囊腺癌7例，透明细胞癌3例；病理分级：G1级9例，G2级19例，G3级18例；腹水：有腹水35例，无腹水11例。收集同期因其他病因而切除的卵巢组织，其中，正常卵巢组织16例，患者年龄45～60岁，中位年龄50岁；卵巢良性肿瘤11例，其中，浆液性囊腺瘤8例，黏液性囊腺瘤3例；患者年龄28～75岁，中位年龄49岁。所有患者术前均未接受放疗、化疗、激素及生物治疗。

1.2 试剂

兔抗人整合素β1多克隆抗体购自上海亿欣生物科技有限公司；兔抗人BRMS1多克隆抗体购自北京博奥森生物有限公司；兔抗人p-AKT（Ser473）抗体购自美国Santa Cruz公司。SP（链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶）免疫组化试剂盒、DAB（3，3-二氨基联苯胺）显色试剂购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色 石蜡标本连续切成4 μm切片，以SP法进行免疫组织化学染色。BRMS1及整合素β1一抗工作浓度为1∶300，p-AKT工作浓度为1∶500。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。二抗工作浓度按照SP试剂盒说明进行。

1.3.2 结果判定 镜下观察，目的蛋白在细胞核和（或）细胞浆着色，呈浅黄、棕黄、黄褐色等不同程度。每张切片镜下（×400）分析阳性细胞所占比例和染色强度，随机观察5个视野。500个细胞中计数阳性细胞比例。细胞计数评分标准：阳性细胞<10%为0分，10%～40%为1分，41%～70%为2分，>70%为3分；染色强度评分标准：不着色者为0分，浅黄色者为1分，棕黄色者为2分，黄褐色者为3分。将两项评分相加，0～1分者阴性（-），2分者弱阳性（+），3～4分者中度阳性（++），5～6分者强阳性（+++）。综合评分结果，（-）为阴性，（+～+++）为阳性。

1.3.3 统计学方法 采用χ2检验和Spearman相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BRMS1、整合素β1、p-AKT蛋白免疫组织化学显色的结果

BRMS1在正常卵巢及良性肿瘤组织中表达于细胞核，而在卵巢癌组织中主要表现为表达缺失，极少数表达于细胞核和（或）细胞质中。整合素β1在正常及良性肿瘤中阳性率极低，而在卵巢癌中主要表达于细胞质及细胞膜中。p-AKT的阳性染色主要定位于癌细胞胞质，少数定位于癌细胞胞核，呈淡黄至棕褐色染色，以弥漫性分布为，在正常卵巢组织及良性肿瘤中几乎不表达（图1）。

BRMS1在卵巢癌中的阳性表达低于正常及良性卵巢肿瘤组织，差异有统计学意义（P<0.01）；整合素β1及p-AKT在卵巢癌中的阳性表达高于正常及良性卵巢肿瘤组织（P<0.01）。以上各指标在正常组织及良性卵巢肿瘤组织之间差异无统计学意义（表1）。

2.2 BRMS1、整合素β1、p-AKT蛋白的阳性表达与卵巢癌临床病理特征的关系

BRMS1在卵巢癌组织中的表达与卵巢癌病理分期，即有无转移相关，与卵巢癌组织学分级无关，临床分期越晚BRMS1表达越低；整合素β1与卵巢癌病理分期有关，临床分期越晚，整合素β1表达越高，G1级高分化与G2级中分化及G2级中分化与G3级低分化之间卵巢癌组织中表达的阳性率，差异无统计学意义（P>0.05）；p-AKT的表达与卵巢癌的分化程度及临床分期显著相关（P<0.05），分化程度越低、临床分期越晚，p-AKT蛋白的阳性表达率越高（表2）。

2.3 BRMS1、整合素β1、p-AKT蛋白在卵巢癌组织中表达间的关系

经Spearman相关分析，卵巢癌组织中BRMS1与整合素β1及p-AKT表达呈明显负相关（r=-0.59，r=-0.50，P<0.05）（表3）。

3 讨论

卵巢癌死亡率多年来未得到明显改善，除了与其恶性度高、病理复杂以及治疗手段有限外，还与其起病隐匿、容易广泛转移、不易早期诊断有关。肿瘤侵袭转移受多种因素影响，如转移抑制基因、转移促进基因、抑癌基因、癌基因等表达失调[6]。BRMS1为一种肿瘤转移抑制基因，其在多种肿瘤中抑制肿瘤在继发部位的生长转移，而不影响肿瘤在原发部位的生长。到目前为止，已经公认的肿瘤抑制基因有KAI1、OGR1、CD44、Nm23、BRMS1等[6]。BRMS1抑制转移的机制包括：恢复细胞缝隙连接介导细胞间信息交流[7]、促进肿瘤细胞失巢凋亡以及在软琼脂上克隆的形成等[8-9]，在分子水平上，BRMS1抑制PI3K/AKT、NF-κB信号通路[10-11]，改变肿瘤转移促进基因，如骨桥蛋白[12]、fascin[13]等的表达。

本研究结果显示，与正常卵巢及卵巢良性肿瘤相比较，BRMS1蛋白在卵巢癌组织中的表达显著降低或缺失，这与文献报道的BRMS1在卵巢癌中mRNA水平表达的结果一致[14]。文献报道细胞中正常的BRMS1蛋白定位于细胞核，而本研究结果显示在卵巢癌组织中，其表达定位发生改变，也表达于细胞质中，而不是仅仅表达在细胞核。说明在卵巢癌中其功能缺失，有时并不一定是蛋白表达的量发生改变，而是与其表达位置异常有关。有研究显示，BRMS1mRNA水平的表达与乳腺癌临床进展和预后关系，存在两种截然相反观点[15-16]。而本研究或许能部分解释这种现象的产生。

有研究显示，BRMS1 mRNA表达与卵巢癌的组织学类型无关，但与临床（FIGO）分期有关，临床分期越晚其表达越低[13]，而我们在蛋白质水平上证实了这个结论，即BRMS1蛋白水平的表达与卵巢癌组织分化无明显关系，而与是否存在转移相关（即FIGO分期相关，因为FIGO分期中Ⅰ期基本无转移，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ存在转移可能性大，故分为Ⅰ期和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期两组），说明BRMS1表达下降与卵巢癌的转移相关。但其具体作用机制不清。整合素β1/AKT信号通路在卵巢癌的恶性表型中起到很重要的促进作用，本研究显示，随着卵巢癌恶性程度及临床期别的增加，整合素β1/AKT信号通路表达增强，进一步证实这一结论。整合素β1在卵巢癌细胞株及组织中普遍阳性表达[4]，且与患者的组织分化、预后呈负相关[5]，本研究结果与文献报道相一致。而目前BRMS1与整合素β1表达之间关系的相关报道极少。我们前期体外实验研究显示，在卵巢癌细胞中，BRMS1表达增强能抑制整合素β1/AKT信号通路，从而抑制卵巢癌细胞的转移侵袭、黏附功能[3]。而本实验在临床标本中对这一结论进行验证。结果显示，在卵巢癌组织中，BRMS1表达与整合素β1、p-AKT表达呈明显负相关。它们在卵巢癌中的表达均与卵巢癌是否发生转移相关。因此可以推测，在卵巢癌中BRMS1有可能通过抑制整合素β1/AKT信号通路，而抑制肿瘤转移，为研究BRMS1抑制卵巢癌的恶性行为提供一个新的观点。

[参考文献]

[1] Ween MP，Oehler MK，Ricciardelli C.Role of versican，hyaluronan and CD44 in ovarian cancer metastasis[J].Int J Mol Sci，2011，12（2）：1009-1029.

[2] Chen H，Hardy TM，Tollefsbol TO.Epigenomics of ovarian cancer and its chemoprevention[J].Front Genet，2011，2： 67.

[3] 饶玉梅，方勇，韩志强，等.BRMS1对卵巢癌细胞c13*转移侵袭的影响及机制[J].华中科技大学学报（医学版）2011，40（2）：131-136.

[4] Cannistra SA，Ottensmeier C，Niloff J，et al.Expression and function of beta 1 and alpha v beta 3 integrins in ovarian cancer[J].Gynecol Oncol，1995，58 （2）：216-225.

[5] Muller-Klingspor V，Hefler L，Obermair A，et al.Prognostic value of beta1-integrin （=CD29） in serous adenocarcinomas of the ovary[J].Anticancer Res，2001，21（3C）：2185-2188.

[6] Stafford LJ，Vaidya KS，Welch DR.Metastasis suppressors genes in cancer[J].Int J Biochem Cell Biol，2008，40（5）：874-891.

[7] Saunders MM，Seraj MJ，Li Z，et al.Breast cancer metastatic potential correlates with a breakdown in homospecific and heterospecific gap junctional intercellular communication[J].Cancer Res， 2001，61（5）：1765-1767.

[8] Phadke PA，Vaidya KS，Nash KT，et al.BRMS1 suppresses breast cancer experimental metastasis to multiple organs by inhibiting several steps of the metastatic process[J].Am J Pathol，2008，172（3）：809-817.

[9] Seraj MJ，Samant RS，Verderame MF，et al.Functional evidence for a novel human breast carcinoma metastasis suppressor，BRMS1，encoded at chromosome 11q13[J].Cancer Res，2000，60（11）：2764-2769.

[10] DeWald DB，Torabinejad J，Samant RS，et al.Metastasis suppression by breast cancer metastasis suppressor 1 involves reduction of phosphoinositide signaling in MDA-MB-435 breast carcinoma cells[J].Cancer Res，2005，65（3）：713-717.

[11] Cicek M，Fukuyama R，Welch DR，et al.Breast cancer metastasis suppressor 1 inhibits gene expression by targeting nuclear factor-kappaB activity[J].Cancer Res，2005，65（9）：3586-3595.

[12] Hedley BD，Welch DR，Allan AL，et al.Dowegulation of osteopontin contributes to metastasis suppression by breast cancer metastasis suppressor 1[J].Int J Cancer，2008，123（3）：526-534.

[13] 张殊，林其德，狄文.BRMS1和fascin基因在卵巢上皮癌中的表达及其意义[J].现代妇产科进展，2003，12（3）：167-169，172.

[14] Zhang S，Lin Q，Ddi W.Suppression of human ovarian carcinoma metastasis by the metastasis-suppressor gene，BRMS1[J].Int J Gynecol Cancer，2006，16（2）：522-531.

[15] Lombardi G，Di Cristofano C，Capodanno A，et al.High level of messenger RNA for BRMS1 in primary breast carcinomas is associated with poor prognosis[J].Int J Cancer，2007，120（6）：1169-1178.

[16] Hicks DG，Yoder BJ，Short S，et al.Loss of breast cancer metastasis suppressor 1 protein expression predicts reduced disease-free survival in subsets of breast cancer patients[J].Clin Cancer Res，2006， 12（22）：6702-6708.

（收稿日期：2013-07-03 本文编辑：林利利）