新城疫病毒ＨＮ基因片段原核表达重组质粒的构建

摘要：根据GenBank中发表的新城疫病毒F48E9基因序列设计引物，采用RT-PCR技术，成功获得了该病毒HN基因中两个不交叉的基因片段，长度分别为790bp和579bp。将这两段基因分别克隆到pGEM-T vector中，经酶切鉴定和测序后克隆到原核表达载体pET-28a，PCR和酶切鉴定表明，克隆的两个新城疫病毒基因片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28a之中。

关键词：新城疫病毒；HN基因片段克隆；原核表达

中图分类号：S852.65+9.5；Q785；Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2008)05-0506-03

Construction of the Prokaryotic Expression Recombinant Plasmids Containing NDV Gene Fragments

ZHAO Yong-xu1，QIAO Xian-feng2，LIU Xi-mei2，HUA Wen-jun2，ZHOU Jing-rong2，ZHENG Xin-min2，ZHANG Miao-tao1

(1.College of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shanxi，China；

2. Institute of Veterinary and Animal Science，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Lab of Animal Embryo & Molecular Breeding，Wuhan 430064，China)

Abstract：Using Primers which were designed according to the sequence of HN gene of NDV F48E9 strain，two cDNA fragments 579 bp and 790 bp in length，of HN gene were successfully amplified by RT-PCR，and they are 579 bp and 790 bp in length. These two amplified cDNA fragments were cloned into pGEM-T vector. The results of identification by restriction endonuclease and sequencing analysis showed that they were successfully inserted into the expression vector pET-28a.

Key words：NDV；HN gene clone；prokaryotic expression

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属副粘病毒科(Paramyxoviridae)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus))，为单股负链RNA病毒，基因组全长15 186 bp，包含6个基因，分别编码6个主要的结构蛋白[1]。其中血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase protein，HN)具有血凝性、神经氨酸酶活性及促融合活性，在NDV侵染过程中负责识别受体，介导病毒吸附于细胞膜上，并能与F蛋白相互作用，共同完成侵染过程[2-5]。HN蛋白的抗原性除由HN蛋白抗原位点区域决定外，还与HN蛋白的成熟及蛋白分子的空间构象有关[6]。 F48E9

株为NDV中国标准强毒株，本试验选取的两段基因基本上包含了HN蛋白的主要抗原位点，通过对HN基因中的两个不交叉片段进行克隆和原核表达载体构建，为进一步研究HN蛋白的抗原性和制备单克隆抗体及诊断性抗原等打下了基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株、质粒及主要试剂

新城疫标准强毒株F48E9购自中国兽医药品监察所；SPF鸡胚购自华中农业大学实验动物中心；Escherichia coli DH5α、BL21(DE3)为本实验室保存；pGEM-T载体连接试剂盒购自Promega公司；PET-28a(+)DNA为Novagen公司的产品。主要试剂有TRIZOL(Invitrogen公司)、质粒小量快速提取试剂盒(博大泰克)、玻奶回收试剂盒(Biostar公司)；M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶NotI、Xhol I、NcoI等均为Promega公司产品。引物合成及重组质粒测序均由Invitrogen公司完成。

1.2 NDV病毒F48E9株的增殖及总RNA的提取

将种毒按1∶1 000倍稀释，接种9日龄SPF鸡胚，37℃孵育24 h，收取尿囊液。按1∶3的比例加入Trizol试剂，按说明书操作提取病毒总RNA。

1.3 引物设计

参考GenBank中F48E9的HN基因序列，用软件Pimer5.0设计两对引物，用于扩增HN基因中两段不交叉的核酸序列。其中引物F1、F2的跨度为790bp，位于HN基因的上游；引物F3、F4的跨度为579bp，位于HN基因的下游；RT为反转录引物。

F1：CCCTCGAGGACCTTGTAGGCATACTGA

F2：CATGCCATGGCCATAGACTGGGAACCAT

F3：CCCTCGAGATTCGGATGGCTAAGTCT

F4：CATGCCATGGTGCTGAGGCAATAGGTTT

RT：ATGGACCGTGTAGTTAGC

下划线为Xhol I和Nco I的酶切位点及保护性碱基。

1.4 RT-PCR反应

使用设计的反转录引物，按Promega公司的M-MLV反转录酶说明书进行反转录。RT反应条件为：75℃ 10 min，迅速冰浴5 min，42℃ 60 min，70℃ 15 min，加入RNase H，37℃ 20 min，65℃ 10 min灭活RNA酶。PCR反应总体积25 μL，其中上下游引物各2.5 μL、dNTP 4 μL、模板2 μL、Taq酶0.5 μL、10×反应缓冲液2.5 μL，灭菌去离子水补足25 μL。PCR反应程序为：94℃ 5 min预变性，94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环，最后72℃ 10 min。取PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，玻璃奶回收试剂盒回收PCR产物。

1.5 扩增产物的克隆和测序

回收片段与pGEM-T vector 连接后转化感受态大肠杆菌 DH5α，涂布于含氨苄青霉素、X-gal，IPTG的LB培养板，37℃培养过夜，随机挑取阳性菌落，加入LB培养基，摇菌后用试剂盒提取重组质粒，用Xhol I和Nco I做酶切鉴定，选取两份初步鉴定正确的重组质粒送至Invitrogen公司进行序列测定。

1.6 目的片段插入表达载体

将上述测序正确的重组质粒和原核表达载体pET-28a分别用Xhol I和Nco I双酶切，电泳后回收目的片段进行连接和转化，筛选阳性菌落，重组表达质粒经酶切和PCR鉴定后转化大肠肝菌BL21(DE3)，进行目的片段的表达。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR法扩增的两个HN基因片段

利用设计的特异性引物对NDV F48E9株的核苷酸进行RT-PCR结果见图1。由图1可以看出，通过RT-PCR扩增出了579bp和790bp的目的条带，与预期片段大小相符。

2.2 重组质粒pGEM-HN1和pGEM-HN2的克隆与鉴定

通过对阳性重组质粒的PCR鉴定，扩增出与目的片段大小一致的条带；用Nco I和Xhol I双酶切鉴定，结果切出的两个条带分别为579 bp，3 000 bp和790 bp，3 000 bp(图2)。由图2可以看出，重组质粒pGEM-HN1和pGEM-HN2经PCR扩增能扩增出目的条带，经Nco I和Xhol I双酶切后分别出现3 kb左右的pGEM-T载体和579 bp、790 bp的插入片段，而测序结果则进一步表明目的基因已经正确地插入到pGEM-T载体中；重组质粒的测序结果也表明已经成功地扩增到了目的片段，并且目的片段已经正确地插入到pGEM-T载体中。

重组质粒pGEM-HN1和pGEM-HN2的测序结果如下(其中横线部分表示插入的目的片段)：

2.3 重组表达质粒pET-HN1和pET-HN2酶切鉴定

对重组质粒pET-HN1和pET-HN2进行了PCR和酶切鉴定，结果(图3)PCR扩增出了579bp和790 bp的两个目的条带；Nco I和Xhol I双酶切后分别出现5 kb左右的空载体和579 bp、790 bp的插入片段，表明目的片段已经正确地插入到了原核表达载体pET-28 a中。

3 小结与讨论

研究表明，HN和F(融合)蛋白构成新城疫病毒囊膜外表面的纤突，是其功能性蛋白，在致病和免疫应答中起重要作用[7，8]，所以HN和F基因成为重组疫苗或基因工程疫苗的首选目的基因[9，10]。HN蛋白抗原位点利用单抗识别的表位在HN蛋白分子上勾画出了球形头部几个独立区域，3个区域193～201(位点23)、345～353(位点14，1)和第513～521残基加上第494、569残基(位点12，2)，位点14、1与12有部分重叠，位点12、2与位点23部分重叠，说明抗原位点的3个区域在分子表面上是集聚在一起的。而在自然结构中HN分子的抗原位点可能是由分子中非连续区域集聚在一起形成的[11，12]。本试验选取的两段基因基本上包含了HN蛋白的主要抗原位点，可以用其对HN蛋白的抗原性进行研究。由于pET-28a表达载体在起始密码子之后有6个His(Tag)标记，因此下一步表达出的蛋白可以用Ni离子亲和层析柱进行分离纯化，纯化后的蛋白可以进行免疫原性研究，以便用于制备诊断性抗原和单克隆抗体等。

参考文献：

[1] MILAR N S，CHAMBERS P，EMMERSON P T，et al. Nucleotide sequence analysis of the hemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle disease virus [J]. Journal of General Virology，1986，67：1917-1927.

[2] WANG Z，IORIO R M. Amino acids substitutions in a conserved region in the stalk of Newcastle disease virus HN glycoprotein spike impair its neuraminidase activity in the gobular domain [J]. J Virol，1999，80：749-753.

[3] CONNARIS H，TAKIMOTO T，RUSSELL R，et al. Probing the sialic acid binding site of the hemagglutinin-neuraminidase of Newcastle disease virus：Identification of key amino acids involved in cell binding，catalysis and fusion [J]. J Virol，2002，76(4)：1816-1824.

[4] SAGRERA A，COBALEDA C，GONZALEZ DE BUITRAGO J M，et al. Membrane glycopyoteins of Newcastle disease virus ：Nucleotide sequence of hemagglutinin-neuraminidase cloned gene and structure function relationship of predicted amino acid sequence[J]. J Glycoconj，2001，18(4)：283-289.

[5] 王志玉，王战勇，于修平.糖化作用对新城疫病毒HN糖蛋白功能的影响[J].病毒学报，2002，18(2)：155-161.

[6] 王志玉. 副粘病毒表面糖蛋白的表达及其相互作用的研究[J].山东医科大学学报，1999，37(2)：117-119.

[7] 曹殿军.鸡新城疫病毒HN基因在重组鸡痘病毒中的表达及其保护性的研究[J].中国免疫学杂志，1998，14(1)：61-64.

[8] 丁 壮.新城疫病毒HN蛋白及其基因的分子生物学[J].中国兽医科技，1999，29(8)：17-21.

[9] 姜永厚. 鸡新城疫病毒F基因和鸡IL-2重组DNA疫苗的构建[J].中国预防兽医学报，2001，23(2)：81-83.

[10] PEETERS B P. Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals[J]. Vaccine，2001，19(13-14)：1616-1627.

[11] IORIO R M，GLICKMAN R L，RIEL A M，et al. Functional and neutralization profile of seven overlapping antigenic sites on the HN glyeoprotein of Newcastle disease virus：Monoclonal antibodies to some sites prevent viral attachment[J]. Virus Res，1989，13(3)：245-261.

[12] IORIO R M，SYDDALL R J，SHEEHAN J P，et al. Neutralization map of the hemagglutinin—neuraminidase glycoprotein of Newcastle disease virus：Domains recognized by monoclonal antibodies that prevent receptor recognition[J]. J Virol，1991，65(9)：4999-5006.

(责任编辑 王 珞)