豚鼠自身免疫性梅尼埃病相关抗原相对分子质量58000蛋白的二维电泳和质谱分析

摘要：目的 探寻导致豚鼠自身免疫性梅尼埃病（autoimmune Meniere"s disease，AIMD）模型的内耳组织抗原成分中相对分子质量为58 000的蛋白质成分。方法 双向凝胶电泳方法分离豚鼠内耳组织抗原成分，用ImageMaster图像分析软件选择相对分子质量为58 000的蛋白质点，对这些蛋白质点进行质谱分析，通过Mascot软件查询Swiss-prot数据库，利用PathwayStudio软件对查询到的蛋白进行生物信息学分析，获得引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。结果 获得重复性和分辨率都较好的双向电泳图谱，软件分析相对分子质量58 000蛋白共获得20个蛋白质点；质谱分析后查询数据库鉴定得到11个蛋白质。这些蛋白分别与免疫、凋亡和分化等功能相关，其中凝血因子C从相对分子质量、Mascot评分和蛋白功能等方面综合评估结果提示其可能作为相对分子质量58000蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白抗原。结论 成功获得豚鼠自身免疫性梅尼埃病模型主要内耳抗原成分中相对分子质量58 000蛋白的双向凝胶电泳图谱，并应用质谱技术鉴定蛋白质点。综合分析提示凝血因子C可能为相对分子质量58 000蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。

关键词：梅尼埃病；自身免疫；内耳抗原

自身免疫性内耳疾病（autoimmune inner ear disease，AIED）是临床上极少数治疗效果较好一类内耳疾病，自身免疫性梅尼埃病（autoimmune Meniere"s disease，AIMD）属于自身免疫性内耳疾病（autoimmune inner ear disease，AIED）的一种。本项目组前期实验研究结果显示，相对分子质量为58 000的内耳组织抗原为导致豚鼠AIMD的主要抗原成分之一[1，2]。本研究拟对豚鼠内耳组织中相对分子量58 000的抗原采用蛋白质组学的技术，进行分离鉴定，为AIMD在特异性抗原方面的进一步研究打下基础。

1资料与方法

1.1实验动物 健康、白色、红目豚鼠3只，3月龄，雌雄不限，体重250～300g，由南京市江宁青龙山动物繁殖场提供，豚鼠耳廓反射正常，耳镜检查排除中耳疾患。

1.2试剂与仪器

1.2.1蛋白质提取、双向电泳 固相pH梯度胶条（24cm，pH3～10NL）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、APS、Tris、超纯尿素、DTT、硫脲、CHAPS、载体两性电解质（Pharmalytes pH3～10）、胶槽清洗液、凝胶覆盖液、碘乙酰胺、低熔点琼脂糖、溴酚兰；BCA试剂盒；十二烷基磺酸钠；蛋白酶抑制剂cocktail、37%甲醛；分子量标准蛋白质（130、95、72、55、43、34、26kD）；甘油、无水乙醇、冰醋酸、无水乙酸钠、碳酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na2）、磷酸、蔗糖、浓盐酸均为国产分析纯；所有溶液均用去离子水配制。

1.2.2质谱分析 乙晴，碳酸氢胺，三氟乙酸，序列修饰后胰蛋白酶。MALDI-MS质谱仪BIFLEXⅣ。

1.2.3免疫印迹法试验 PVDF膜（Millipore Corporation）；化学发光试剂盒（Cell Signaling Technology，Inc）。CS-15R台式高速冷冻离心机；Bio-Rad ModeL 680垂直电泳槽、电转移槽；

1.3方法

1.3.1抗原制备 制备豚鼠内耳组织抗原[3]，方法：清醒状态下断头，取听泡，分离膜迷路（主要包括螺旋韧带、基底膜、膜半规管、椭圆囊和球囊），置于150μl裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT，2%IPG缓冲液，1%Cocktail，去离子水），经剪切、超声粉碎及均浆，12000 r/min 4℃离心5min，取上清贮于-80℃备用。用BCA法测蛋白质浓度。

1.3.2双向凝胶电泳 第一相固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等电聚焦主要参照G？紫rg等[4]的方法进行，简述：采用pH3～10NL，24cm干胶条，每份以120μg内耳抗原总蛋白质与水化液（8mol/L尿素、20mmol/LDTT、2%CHAPS、0.5%IPG缓冲液以及0.001%溴酚兰）充分混合，总体积450μl。用IPGphor等电聚焦仪，进行第一向等电聚焦，在20℃下自动运行。

1.3.3凝胶染色和扫描及图像分析 双向电泳后的2-DE胶，为了制备蛋白用于质谱分析而采用硝酸银染色。染色后的双向电泳凝胶用ImageScannerTM扫描仪进行透射扫描，数字化图象文件运用Amersham Pharmacia公司的ImageMasterR 2D Elite（Version 2.00）软件分析。比较3次重复结果图谱，获得标准图谱。选择相对分子质量为58 000的20个蛋白质点进行下一步实验。

1.3.4质谱分析及数据库查询 选取2-DE凝胶上相对分子质量为58 000的20个蛋白质点在图像上做好标记，编号为1～20。20个蛋白质点在经过切胶、脱色、干胶后进行酶切、点样。得到的肽质量指纹图谱利用Mascot搜索引擎（http：////mascot/cgi/search_form.pl？FORMVER=2&SEARCH=PMF）进行数据库检索，其中蛋白质数据库选择SwissProt库。结合双向电泳图谱上相应点的等电点、分子量综合分析。

2结果

2.1二维电泳及凝胶分析结果：电泳后的凝胶图谱呈现良好的重复性和稳定性，经图像软件分析相对分子质量为58 000的共有20个蛋白质点（图1）。将这20个蛋白质点从1～20依次编号，并对其进行质谱分析。

图1 豚鼠内耳组织抗原双向凝胶电泳图谱

1～20分别为相对分子质量为58kD的20个蛋白质点。

2.2质谱结果及生物信息学分析 将这20个蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析，以基质峰和酶自动降解峰进行校正，获得各蛋白点的肽片断质量指纹图谱。用Mascot搜索引擎在SwissProt数据库进行查询，结合双向电泳图谱上相应点的表观等电点、分子量综合分析，前17个蛋白质点被成功鉴定，部分蛋白质点得到同一种蛋白，总共获得11个蛋白（图2）。第一个蛋白点得到两个蛋白，其余各点都为一个蛋白；1、7、9、10、15和17六个点都得到凝血因子C，从相对分子质量、Mascot评分和蛋白功能等方面综合评估，凝血因子C可能为58kD蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白。

图2 质谱分析后在SwissProt数据库搜索到的蛋白质

蛋白质点1～17经分析得到结果，第一个蛋白点为混合点，分别得到两个蛋白，其余各点为一个蛋白。

3讨论

内耳自身免疫性病理损伤在感音神经性聋（sensorineural hearing loss，SNHL）、梅尼埃病（Meniere"s disease，MD）等内耳疾病的发生及其病理机制中可能起着重要作用[5，6]。实验研究证实多种内耳抗原在AIED的发病中起重要作用，对这些内耳抗原的研究将有助于找到敏感而特异的血清学检测方法，作为临床诊断的重要依据。

之前的研究初步筛选出分子量为68KD、58KD、42KD、28KD的蛋白质可能是致内耳自身免疫病理损伤的主要抗原成分[1]，发现68kD蛋白中引起豚鼠自身免疫性梅尼埃病的主要蛋白为波形蛋白[7]。本研究拟对豚鼠内耳组织中相对分子量58KD的抗原采用蛋白质组学的技术，进行分离鉴定，为AIMD在特异性抗原方面的进一步研究打下基础。我们用双向凝胶电泳方法分离豚鼠内耳组织抗原成分，用ImageMaster图像分析软件选择获得20个相对分子质量为58kD的蛋白质点，对这些蛋白质点进行质谱分析，通过Mascot软件查询Swiss-prot数据库，最后得到11个蛋白，其中六个点都得到凝血因子C。

58kD蛋白在自身免疫性内耳疾病的研究中非常重要，而其成分究竟为何仍存在争议，Boulassel[8]等发现多种内耳疾病患者血清可以与58kD内耳蛋白反应进而通过实验推断58kD蛋白是COCH5B2蛋白。凝血因子C同源物（coagulation factor C homology，COCH）基因是人类发现的第一个伴前庭功能障碍的常染色体显性遗传非综合征性耳聋基因，在耳蜗和前庭组织中有高度表达，COCH基因突变可致患者出现渐进性感音神经性耳聋、前庭功能障碍症状[9]。

过去研究表明自身免疫因素是内耳疾病的病因之一，但这些免疫介导的听力损失尚缺乏明确的诊断标准，主要依赖听力学损害、免疫试验阳性及应用激素治疗有效来判断。我们项目组将对这些内耳抗原继续研究，进而找到敏感而特异的血清学检测方法。

参考文献：

[1]陆玲，谭长强，崔毓贵，等.豚鼠自身免疫性梅尼埃病模型的主要内耳抗原分析[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，43（8）：596-600.

[2]李玉瑾，谭长强，黄和，等.纯化内耳组织抗原免疫致豚鼠自身免疫性梅尼埃病的实验研究[J].东南大学学报（医学版），2009，28（3）：157-162.

[3]谭长强，董伟达，陆玲.同种内耳抗原免疫孕豚鼠所产子鼠听觉损伤程度与母鼠特异性免疫反应水平相关性研究[J].东南大学学报（医学版），2007，26：397-402.

[4]G？rg A，Obermaier C，Boguth G，et al.The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J]. Electrophoresis，2000，21（6）：1037-1053

[5]Quinton Gopen，Elizabeth M.Keithley，et al.Mechanisms underlying autoimmune inner ear disease[J]. Drug Discovery Today：Disease Mechanisms，2006，3：137-142

[6]肖红俊，龚树生，汪吉宝.三种原因不明内耳病抗内耳组织自身抗体的检测[J].中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30：17-19.

[7]李王伟，董伟达，谭长强等豚鼠自身免疫性梅尼埃病相关抗原相对分子质量68 000蛋白的二维电泳和质谱分析[J].东南大学学报（医学版），2011，30（3）：417-422.

[8]Boulassel MR，Tomasi JP，Deggouj N，et al.COCH5B2 is a target antigen of anti-inner ear antibodies in autoimmune inner ear diseases[J]. 6Otol Neurotol，2001，22（5）：614-618

[9]孙勍，于飞，刘新.等.自身免疫性感音神经性聋患者候选基因--凝血因子C同源物突变筛查[J].chinese journal of otology，2008，6（3）：302-305.

编辑/申磊