青蒿琥酯—转铁蛋白复合物抑制癌细胞增殖的初步研究

摘要： 采用简单、快捷的药物配体自识别的方式制备了青蒿琥酯（ATS） -转铁蛋白（Tf） 复合物（ATS-Tf）.紫外-可见光谱分析表明：在正常生理条件（pH=7.4）下，ATS与Tf 易自组装形成稳定的ATS-Tf复合物（结合常数Kf为3.4×105 L/mol）；而在酸性条件（pH=5.5）下，结合能力相对变弱（Kf=1.7×104 L/mol），ATS易与Tf分离，具有良好的pH敏感性.同时研究了该复合物对细胞增殖的抑制作用，结果表明：ATS-Tf复合物对正常肝细胞L-02的毒性较低，而对人肺腺癌细胞A549、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC-803的增殖具有显著的抑制作用，表现出良好的靶向杀伤性，有望开发成新型靶向抗肿瘤药物.液相色谱法证实Tf增强了癌细胞对ATS的摄取能力.进一步通过分子对接模拟和荧光光谱分析对ATS与Tf的结合模式和机理进行了研究，提出了ATS-Tf靶向抑制癌细胞增殖的可能机理.研究为青蒿琥酯靶向抗肿瘤药物的研发提供了理论支持和实验依据，在癌症治疗领域具有良好的应用前景.

关键词： 青蒿琥酯； 转铁蛋白； 分子对接； 光谱分析； 抗癌活性

中图分类号： Q 599文献标识码： A文章编号： 10005137（2013）06061508

青蒿琥酯（Artesunate，ATS） 是从天然植物青蒿中提取的一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物[1]，是目前常用的抗疟特效药之一.20世纪90年代以来，科学家发现除良好抗疟性之外，青蒿琥酯对多种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用[2]，而对正常组织细胞的毒性较低[3]，同时与传统化学治疗药物有协同增效作用且无交叉耐药性[4].青蒿琥酯抗肿瘤作用的机理包括抑制或杀伤肿瘤细胞、阻滞细胞周期、抑制血管生成、Fe2+诱导的细胞凋亡等[4-5]，其中Fe2+诱导的细胞凋亡机理被广泛接受，即Fe3+与Tf形成的全铁转铁蛋白（holo-Tf）进入细胞的胞吞体后Tf的构象发生改变形成脱铁转铁蛋白（apo-Tf），并释放出Fe3+；释放的Fe3+在铁还原酶STEAP3的作用下生成Fe2+ [6]，使ATS内的过氧键断裂，产生大量自由基，破坏细胞膜和生物大分子，引起DNA断裂，从而诱导细胞凋亡[5].

在Fe2+诱导ATS促细胞凋亡机制中，转铁蛋白（Transferrin，Tf）和转铁蛋白受体（Transferrin Receptor，TfR）发挥着重要作用.Tf是细胞内铁元素的转运载体，TfR的介导作用实现了铁元素在细胞内外的运输.由于癌细胞膜表面大量表达TfR，而正常细胞表面TfR表达较少[7]，当Tf与ATS结合后，由于TfR的介导作用，进入癌细胞的ATS较多，从而对癌细胞产生靶向杀伤作用[8].由于游离的ATS容易扩散而无选择性地进入细胞，导致对正常细胞也有一定毒性[9]；而当ATS与Tf结合后，由于Tf本身对癌细胞的靶向性使得ATS对正常细胞的毒性显著降低.有实验证实当ATS与Tf联合用药时对鼻咽癌CNE2细胞的增殖抑制作用是单独使用ATS时的5倍以上[10]，表现出更好的靶向杀伤作用.

尽管前人对ATS与Tf联合使用时对癌细胞的抑制作用进行了相应的实验研究，但对ATS与Tf结合进入细胞后的抗癌作用机理却未进行明确的阐述与系统的研究，而且对Tf是否确实能增强ATS对癌细胞的靶向杀伤作用也说法不一[10-11].有鉴于此，为深入探究ATS与Tf相互作用时的机理，提高ATS的抗癌活性，并开发新型靶向抗肿瘤制剂，本文作者采用简单、快捷的药物配体自识别的方式制备了青蒿琥酯-转铁蛋白复合物（ATS-Tf）；通过紫外-可见光谱，研究了复合物在正常生理条件（pH=7.4）和酸性条件下（pH=5.5）结合常数Kf的变化；通过体外细胞实验研究了ATS-Tf对人肺癌、肝癌、胃癌细胞及正常肝细胞的增殖抑制作用；通过对接模拟和光谱分析，对ATS与Tf结合时的作用模式和机理进行了研究；采用液相色谱法探究了Tf对癌细胞摄取青蒿琥酯的影响.本研究提出了ATS-Tf抑制癌细胞增殖的可能机理，为青蒿琥酯靶向抗癌药物的研发提供了理论支持和实验依据，在癌症的治疗领域具有良好的应用前景.

上海师范大学学报（自然科学版）2013年第6期杨艳，张晓敏，汪小芬，等：青蒿琥酯-转铁蛋白复合物抑制癌细胞增殖的初步研究1实验部分

1.1仪器和试剂

ChemDraw软件（美国CambridgeSoft公司）；Dsicovery Studio（DS）模拟软件（V3.1，美国Accelrys公司）；酶标仪（Multiskan MK3，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）；CO2细胞培养箱（BC-J160-S，上海博迅实业有限公司）；紫外-可见分光光度计（UV-2450，Kyoto Japan）； 荧光分光光度计（Cary Eclipse，Agilent Technologies）；高速离心机（TGL-16M，湘仪离心机仪器有限公司）；高效液相色谱（Ultimate-300，美国戴安）.

青蒿琥酯（ATS）购于桂林南药股份有限公司；人类血清转铁蛋白（Tf）购于Sigma公司；四甲基偶氮唑盐（MTT），醋酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS）购于阿拉丁试剂；RPMI-1640培养液，DMEM培养液，胎牛血清（FBS），二甲基亚砜（DMSO），胰蛋白酶，磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）购于上海励瑞生物科技有限公司.乙腈，无水乙醇，冰醋酸购于国药集团；乙二胺四乙酸（EDTA）购于生工生物.细胞株（包括人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC-803、人正常肝脏细胞L-02）由中科院上海细胞所提供.

1.2转铁蛋白与青蒿琥酯的分子对接模拟

采用ChemDraw软件的标准键长和键角来搭建青蒿琥酯的结构，化合物模板见图1a，然后导入DS软件中进行能量最小化.计算用的Tf晶体结构1D4N从蛋白质数据库（.cn/qkpdf/shhb/shhb201306/shhb20130608.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文

1.3转铁蛋白与青蒿琥酯相互作用的光谱分析

紫外-可见吸收光谱的测定[14]：转铁蛋白分别溶于PBS缓冲液（pH=7.4）和醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=5.5，含EDTA）配制成3.0×10-6mol/L的Tf溶液，移取3 mL于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐次加入上述配制好的ATS溶液并混合均匀，静置10 min以形成ATS-Tf复合物，以相同浓度的ATS溶液作为参比，绘制200～700 nm的紫外光谱.

荧光光谱的测定：转铁蛋白溶于PBS缓冲液（pH=7.4）配制成3.0×10-6mol/L的Tf溶液，青蒿琥酯溶于无水乙醇配制成l.0×10-3mol/L的溶液.移取3 mL Tf溶液于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐次加入ATS溶液并混合均匀，静置10 min后进行光谱滴定，以λex=280 nm，测定300～500 nm的荧光光谱.

1.4ATS-Tf 复合物对细胞增殖的抑制作用

将传代培养48 h后呈指数生长的A549、HepG2、MGC-803和L-02细胞调整密度至5×104个/mL.分别向96孔板中加入调好密度的细胞悬液100 μL，于37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养12 h后，吸掉旧的培养液，各加入设定好浓度的ATS-Tf复合物溶液100 μL（ATS-Tf复合物的制备：Tf 先溶于1.0 mL不含FBS的细胞培养液，配成不同浓度的Tf溶液，设定浓度分别为100、50、20、10、5、2、0 μmol/L，ATS溶于DMSO形成10 mmol/L的ATS溶液，向Tf溶液中各加入10 μL ATS溶液并涡流混合，静置20 min后各加入10%的FBS），每个浓度设3个复孔.置于CO2培养箱内培养48 h后，每孔加入用PBS溶解的MTT（5 g/L）30 μL，继续培养4 h后弃上清，每孔加入100 μL DMSO溶液，低俗震荡10 min以充分溶解蓝紫色颗粒，放入Multiskan MK3酶标仪中，于492 nm波长处检测各孔吸光度（A）值[15].

1.5转铁蛋白对癌细胞摄取青蒿琥酯的影响

使用高效液相色谱法（HPLC）绘制ATS标准曲线.HPLC色谱条件：Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液（42∶58），流速：1.0 mL·min-1，检测波长：210 nm，柱温：30℃，进样量：20 μL[16].将MGC-803细胞密度调整至1×105个/mL后铺6孔板，每孔加入500 μL细胞悬液，置于CO2 培养箱中培养，培养2 d后吸掉旧的培养液，每孔加入配好的不同摩尔比的ATS-Tf药物500 μL，于培养箱中分别孵育2、4、8 h.PBS洗涤3次后加入胰酶消化细胞，收集细胞并计数，2 000 r/min离心5 min，取沉淀加入100 μL 10% SDS超声30 min，加入300 μL乙腈涡旋萃取，14 000 r/min离心5 min，取上清过0.22 μm滤膜后HPLC进样[17].将峰面积代入到标准曲线中可得被细胞吞噬的药物的量.

2结果与讨论

2.1转铁蛋白与青蒿琥酯的分子对接研究

图1青蒿琥酯的化学结构（a）和青蒿琥酯与转铁蛋白的分子对接图（b）（虚线代表氢键）为了探究青蒿琥酯与转铁蛋白相互作用的模式，本实验将ATS与Tf 进行半柔性分子对接，对接结果见图1b.从图1可知，ATS进入Tf分子内离Fe3+键合位点（Tyr-188、His-249）和稳定键合位点（Arg-124）较近的活性腔，与Tyr-188、His-249 和 Arg-124 形成较强的氢键作用，且这3个氨基酸残基与ATS的距离均小于0.5 nm.同时计算了正常生理条件（pH=7.4）和酸性条件（pH=5.5）下ATS 与 Tf 的相互作用能（表1），分别为-68.0420和-42.1465 kcal/mol，表明在正常生理条件下ATS与Tf 易形成稳定的复合物；而在酸性条件下ATS与Tf的结合相对变弱，ATS易与Tf分离，进一步表明在酸性条件下，当Fe3+从Tf上分离并被还原成Fe2+时，ATS也从复合物ATS-Tf中解离，从而有利于ATS内过氧键的断裂和自由基的产生，并发挥抗癌活性.

2.2转铁蛋白与青蒿琥酯相互作用的光谱研究

转铁蛋白由于含色氨酸和酪氨酸残基，在280 nm有较强的紫外吸收峰（图2a）.固定Tf的量，逐次添加ATS，可以看出随着ATS的加入，Tf在280 nm处的吸收峰强度逐渐降低（图2b），表明ATS与Tf的基态分子发生了相互作用，生成了基态配合物，从而引起转铁蛋白紫外吸收光谱的变化[12].ATS与Tf作用时的结合常数可以根据下列公式计算得到[18]：A0/（A - A0） = εTf/（εATS-Tf- εTf）（1+1/Kf[ATS]）.其中A0为未加ATS时Tf 的吸光值，A为加入不同浓度ATS后Tf的吸光值，εTf和εATS-Tf分别为Tf和ATS-Tf的摩尔吸收系数，Kf为结合常数，[ATS]为ATS的浓度.Kf由A0/（A - A0）～1/[ATS]曲线的截距和斜率比得到；根据公式计算出pH为7.4和5.5时 Kf分别为3.4×105L/mol和1.7×104 L/mol，表明结合常数在酸性条件下显著下降.这与分子对接模拟的结果相一致，进一步表明在中性条件下ATS与Tf容易结合，形成稳定的复合物；而当pH从中性变为酸性时，ATS与Tf的结合能力变弱，ATS-Tf 容易发生解离，释放出ATS.随着Tf 在细胞内外的不断循环[19]，ATS就通过TfR介导的内吞作用实现了在细胞内的积累，从而发挥抗癌活性.

当激发波长为280 nm时，青蒿琥酯在300～500 nm范围内无荧光，转铁蛋白由于色氨酸和酪氨酸残基在330 nm处产生内源荧光（图2a）.在室温下（290±1 K），Tf在330 nm处的吸收峰强度随ATS浓度的增加而降低（图2c），荧光产生有规律的淬灭，表明ATS与Tf发生了相互作用，引起Tf发色基团周围微环境的改变，从而使荧光强度发生变化[20].为确切证实ATS与Tf相互作用的淬灭过程，研究了不同温度下淬灭常数Ksv的变化，Ksv可根据Stern-Volmer方程得到：F0/F = 1 + Ksv/[ATS].其中F0为未加ATS时的荧光强度，[ATS]为ATS的浓度，Ksv为淬灭常数，由淬灭曲线斜率求得Ksv.当温度为（310±1）K时Ksv为2 758 L/mol；当温度为（290±1）K时Ksv为2 727 L/mol，表明随着温度的升高，ATS与Tf 相互作用的淬灭常数降低，证明该过程为静态淬灭过程[21].根据静态淬灭方程lg [（F0-F）/F]= lgK +nlg [ATS] [14]计算出（290±1）K条件下ATS与Tf的结合位点数（n）为0.64，接近于1，表明ATS与Tf接近按等摩尔进行结合.2.3ATS-Tf 对癌细胞增殖的抑制作用研究

图3a显示了不同浓度的ATS对癌细胞A549、HepG2、MGC-803和正常细胞L-02的增殖抑制作用；虽然随着ATS浓度的增大各种细胞的存活率均呈下降趋势，但ATS对癌细胞的抑制效果在各浓度下均显著高于正常细胞（p<0.05），证明ATS是较安全的抗癌药物.根据图3a的结果，选取[ATS]=100 μmol/L来研究Tf的加入和ATS/Tf的结合比对癌细胞和正常细胞的抑制作用的影响.MTT结果（图3b）表明ATS-Tf复合物对A549、HepG2、MGC-803细胞的增殖抑制作用均比单独使用ATS时抑制作用明显，当ATS与Tf的结合比为100∶100时增殖抑制效果最佳，证明Tf的加入增强了ATS的抑癌效果.在相同结合比下，ATS-Tf复合物对3种癌细胞的增殖抑制作用均高于人正常肝细胞（L-02）；转铁蛋白的加入对人正常细胞的杀伤作用无明显增强，表明ATS-Tf复合物对癌细胞具有良好的靶向杀伤作用，有望开发成新型靶向抗肿瘤药物制剂.

2.4转铁蛋白增强癌细胞对青蒿琥酯的摄取

采用高效液相色谱法探究了Tf对癌细胞摄取ATS的影响.由图4可见，当ATS浓度一定时（100 μmol/L），增大Tf与ATS的结合比，MGC-803细胞内ATS的含量增大，癌细胞对ATS的摄取能力明显增强.当Tf∶ATS =50∶100 时，细胞对ATS-Tf复合物中ATS的摄取能力是单独使用ATS时的3倍以上，表明ATS-Tf通过TfR介导的内吞作用增强了癌细胞对ATS的摄取能力，从而引起ATS在癌细胞体内的积累，增强抗癌活性.

2.5转铁蛋白-青蒿琥酯复合物抑制癌细胞增殖的机理

在上述理论与实验研究的基础上，提出了ATS-Tf复合物发挥靶向抗癌活性的可能机理（图5）.在细胞外的生理条件下（pH =7.4），Tf与Fe3+的亲和力较高，以全铁转铁蛋白（holo-Tf）的形式存在，ATS通过药物-配体自识别方式与全转铁蛋白结合（结合常数Kf为3.4×105 L/mol）.ATS-Tf与膜表面TfR结合，并由TfR介导，ATS-Tf/TfR与质膜内陷形成胞吞体.在胞吞体膜质子泵的作用下，胞吞体酸化，pH下降到5.5，引起转铁蛋白构象的改变，释放出Fe3+，释放的Fe3+在铁还原酶STEAP3的作用

下生成Fe2+.此时ATS-Tf发生解离，释放出ATS（Kf=1.7×104 L/mol）；Fe2+与ATS结合生成自由基，生成的自由基攻击细胞膜性结构和生物大分子，引起DNA断裂，诱导细胞凋亡，从而发挥靶向抗肿瘤活性.

3结论

采用简单快捷的药物-配体自识别的方式制备了青蒿琥酯-转铁蛋白复合物（ATS-Tf）.光谱实验和分子对接结果证明ATS与Tf可通过氢键和范德华力自组装形成pH敏感的ATS-Tf复合物.体外细胞实验表明ATS-Tf复合物对癌细胞（A549、HepG2、MGC-803）具有靶向杀伤作用，而对正常细胞（L-02）毒性较低，具有较好的靶向性和抗癌活性.最后，结合理论分析和细胞实验结果对ATS-Tf抑制癌细胞增殖的机理进行了探讨.这种制备简便、具有pH敏感性和靶向性的ATS-Tf复合物在癌症的治疗领域具有良好的应用前景.

参考文献：

[1]李静，杨斌，陈永顺.青蒿琥酯对人肝癌HEPG-2细胞增殖作用的研究[J].时珍国医国药，2008，19（4）：823-824.

[2]张燕丽.青蒿琥酯抗肿瘤作用研究进展[J].中医药信息，2009，26（6）：133-135.

[3]GONG Y，GALLIS M，GOODLETT R.Effects of transferrin conjugates of artemisinin and artemisinin dimer on breast cancer cell lines [J].Anticancer Research，2013，33（1）：123-132.

[4]李天星，姚朗.青蒿素类药物抗肿瘤作用的基础与临床研究[J].中国新药与临床杂志，2008，27（3）：227-230.

[5]赵春景，李攀.青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用[J].中国医院用药评价与分析，2004，4（4）：252-253.

[6]STEERE N，BYME L，CHASTEEN D，et al.Kinetics of iron release from transferrin bound to the transferrin receptor at endosomal pH[J].Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects，2012，1820（3）：326-333.

[7]曹冠雄，周红.青蒿素及其转铁蛋白复合物靶向治疗肿瘤研究进展[J].药学进展，2011，30（12）：1602-1605.

[8]余梦辰，潘夕春，李小丽，等.青蒿琥酯增加小鼠腹腔巨噬细胞内化内毒素、大肠埃希菌的作用及可能机制[J].中国临床药理学与治疗学，2012，17（1）：40-46.

[9]谢伟玲，杨培慧，曾鑫.DBAH-Tf靶向药物及其对乳腺癌细胞的杀伤作用分析[J].分析化学，2009，37（5）：671-675.

[10]郑青，郭建红，周仲楼.转铁蛋白对青蒿琥酯体外抗肿瘤活性的增效作用研究[J].中草药，2008，39（6）：887-889.

[11]KELER G，STEINBACH D，KONKIMALLA V B.Role of transferrin receptor and the ABC transporters ABCB6 and ABCB7 for resistance and differentiation of tumor cells towards artesunate [J].PLoS ONE，2007，8（2）：e798.

[12]柳乃方，屈凌波，相秉仁.青蒿素类化合物抗肿瘤机制研究-青蒿素类化合物/转铁蛋白对接研究[J].药学学报，2009，44（2）：140-142.

[13]HIRASHIMA A，HUANG H.Homology modeling agonist binding site identification and docking inoctopamine receptor of Periplaneta americana[J].Computational Biology and Chemistry，2008，32（3）：185-190.

[14]CAI H H，YANG P H，CAI J Y.Binding of artemisinin to holotransferrin：Electrochemical and spectroscopic characterization[J].Journal of Electroanalytical Chemistry，2008，619（1）：59-64.

[15]苗立云，张祖贻.青蒿琥酯选择性抗肺腺癌细胞的作用及其机制[J].现代医学，2006，34（1）：15-17.

[16]QIAN G P，YANG Y W，REN Q L.Determination of artemisinin in Artemisia annua L.by reversed phase HPLC[J].Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies，2005，28（5）：705-712.

[17]TAO Y，HAN J，DOU H.Surface modification of paclitaxel-loaded polymeric nanoparticles：Evaluation of in vitro cellular behavior and in vivo pharmacokinetic[J].Polymer，2012，53（22）：5078-5086.

[18]DANG X J，NIE M Y.Inclusion of 10-methylphenothiazine and its electrochemically generated cation radical by β-cyclodextrin in water + methanol solvent mixtures[J].Journal of Electroanalytical Chemistry，1997，437（1）：53-59.

[19]TRACY R，DANIELS A，EZENQUIEL B.Transferrin receptors and the targeted delivery of therapeutic agents against cancer [J].Biochim Biophys Acta，2012，1820（3）：291-317.

[20]李晓燕.用荧光光谱和共振光散射光谱研究甲硝唑与牛血清白蛋白的相互作用[J].物理化学学报，2007，23（2）：262-267.

[21]SADAVA D，PHILLIPS T，LIN C.Transferrin overcomes drug resistance to artemisinin in human small-cell lung carcinoma cells[J].Cancer letters，2002，179（2）：151-156.

[22]邵爽，马博英，王学杰，等.头孢地嗪钠与牛血清白蛋白相互作用研究[J].物理化学学报，2005，21（7）：792-795.

Abstract： Artesunatetransferrin（ATS-Tf） adduct was prepared through drugligand selfassembly.UVvis spectrum analysis showed that ATS-Tf adduct can be easily formed with relatively high binding constant at neutral pH（3.4×105 L/mol at pH=7.4）.However，the adduct became less stable with low binding constant at acidic condition（1.7×104 L/mol at pH=5.5）.Proliferation inhibition studies of ATS-Tf adduct on cancer cells and normal cells showed that the ATS-Tf adduct had better antitumor activity on human to hepatocellular carcinoma cell （HepG2），lung adenocarcinoma cell （A549），and gastric carcinoma cell（MGC-803），while it had low toxicity on normal human liver cell（L-02）.HPLC analysis confirmed that the incorporation of Tf increased the uptake of ATS by cancer cells.The interactive model and mechanism of ATS with Tf were further studied by molecular docking and fluorescence spectroscopy analysis.The possible inhibition mechanism of ATS-Tf adduct on cancer cells was also proposed.

Key words： artesunate； transferrin； molecular docking； spectral analysis； antitumor activity

（责任编辑：郁慧）