番茄黄化曲叶病毒在湖北首次报道

摘要

2014年春季，在湖北省武汉市发现种植的番茄表现植株矮缩，叶片上卷，叶缘黄化等症状。PCR检测结果显示，所有采集的病样中均存在菜豆金色花叶病毒属病毒。进一步通过滚环扩增方法获得了该病毒的湖北分离物HB01的全基因组。基因克隆及序列分析结果表明，该病毒基因组全长为2 781 nt，与已报道的番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）各分离物同源性在89.0%以上，而与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源率均在97.0%以上。因此，HB01属于TYLCV的一个分离物。

关键词

番茄黄化曲叶病毒；基因克隆；序列分析

中图分类号：

S 432.41

文献标识码：B

DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.046

Abstract

In spring of 2014， tomato plants in Hubei Province exhibited severely dwarf， and leaves upward curling and prominent yellowing along margins symptoms. PCR detection indicated that the diseased plants were infected by Begomovirus. Using rolling circle amplification （RCA） method， the fulllength DNA of the Begomovirus isolate HB01 was obtained. Sequence analysis and BLAST results indicated that the genome of HB01 had 2 781 nucleotides， which had 89.0% identities with other isolates of Tomato yellow leaf curl virus from GenBank， and more than 97.0% identities with other isolates of Tomato yellow leaf curl virus from China. Therefore， the virus infected tomato in Hubei was an isolate of Tomato yellow leaf curl virus.

Key words

Tomato yellow leaf curl virus；gene cloning；sequence analysis

番茄黄化曲叶病是世界范围内严重影响番茄生产的一种重要病害，已给热带和亚热带地区的番茄生产造成严重损失[1]。田间番茄染病后表现为植株矮化，叶片黄化、变小，叶片边缘向上卷曲。生长发育早期染病时，植株无法正常开花结果；后期染病，植株上部新叶表现症状，结果量减少，果实变小，失去市场价值。

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是引起全球各地番茄黄化曲叶病的主要病原之一。该病毒属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）成员，其基因组仅含A组分（DNAA），为单链环状；该病毒由烟粉虱以持久方式传播，同时可经嫁接传播，不能经机械摩擦或种子传毒；其寄主有番茄、曼陀罗、辣椒、菜豆、烟草等[2]。TYLCV最先在以色列发现，之后随着烟粉虱在全球范围暴发而蔓延至中东、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亚洲等多个国家和地区[3]。2006年，该病毒传入我国上海[4]，之后在浙江、江苏、安徽、山东、河北、天津及北京等多个省市发生，造成严重损失[515]。2014年春季，湖北省武汉市田间番茄病株表现出严重的黄化、曲叶症状，疑似感染了双生病毒。为了明确引起湖北省武汉市番茄黄化曲叶病的病原种类，笔者对6份病样进行了病原分子鉴定，对代表分离物的全基因组进行了克隆及序列分析。

1材料与方法

1.1供试样品

6份疑似番茄黄化曲叶病的病叶片（编号分别为HB01～06）采自湖北省武汉市一个试验大棚，病株表现为植株矮缩，叶片皱缩、叶缘黄化；3份阳性样品为本实验室通过农杆菌介导TYLCV侵染性克隆注射接种发病的番茄叶片；2份阴性样品为本实验室保存的健康番茄叶片。

1.2供试番茄样品总DNA提取

利用CTAB方法[16]提取各供试番茄叶片组织的总DNA。

1.3PCR 检测

利用菜豆金色花叶病毒属病毒通用简并引物AV494/CoPR[1718]，对11份供试样品进行PCR检测。

1.4RCA扩增及酶切分析

随机挑取PCR检测为阳性的病样HB01和HB02总DNA，分别取1.0 μL为模板，利用TempliPhiTM RCA Kit （GE Healthcare）进行滚环扩增（rolling circle amplification，RCA），以获得病毒的全基因组。具体方法按照试剂盒说明书上的步骤进行。

RCA反应结束后，扩增产物分别用BamH I、Hind Ⅲ、Pst I限制性内切酶进行酶切。酶切反应体系为：RCA产物2 μL、内切酶1 μL、10×内切酶缓冲液1 μL，总酶切反应体系为10 μL。在37 ℃条件下酶切2 h以上，然后进行电泳分析。若某个内切酶的酶切产物为2.5～3.0 kb，或同时还产生1.3 kb左右的条带，则克隆这些特异性条带。

1.5序列分析

利用DNAStar软件（DNASTAR Inc，Madison，USA）进行序列拼接，利用BLAST程序进行序列相似性搜索，进一步用DNAStar的MegAlign进行序列比较分析，进化树构建采用MEGA 5.05的邻接法（neighbor joining，NJ）。

2结果与分析

2.1PCR检测结果

利用菜豆金色花叶病毒属病毒特异简并引物AV494和CoPR进行PCR检测，从6份表现黄化、曲叶症状的番茄病样（编号分别为HB01～06）总DNA中均扩增到1条与阳性对照大小一致的特异片段，长度为570 bp，而健康植株样品总DNA中未扩增出任何片段（见图1）。表明6份样品中均含有菜豆金色花叶病毒属病毒。

2.2病毒分离物基因组的克隆与序列分析

选取病样HB01和HB02的总DNA分别进行RCA和酶切反应，结果显示，其RCA产物均能被BamH I切出1条约2.7 kb大小的单一条带。克隆和序列测定结果表明，这2个片段序列全长均为2 781 nt，且两者的序列同源率为99.8%，即为病毒分离物DNAA的全基因组。以HB01的全长序列代表该病毒分离物基因组，其GenBank登录号为KJ850344。

病毒分离物HB01的基因组全长序列具有单组分菜豆金色花叶病毒属成员基因组DNAA的典型特征，为单链闭合环状，推导编码6个ORFs。基因组病毒链含AV1基因 （308～1 084 nt，编码CP）和AV2基因 （148～498 nt，编码与病毒移动相关蛋白），互补链含有AC1基因（1 542～2 615 nt，编码复制酶）、AC2基因（1 226～1 633 nt，转录激活蛋白）和AC3基因（1 081～1 485 nt，编码复制增强蛋白）和AC4基因（2 171～2 464 nt）。在AV2与AC1之间有一个313 nt的非编码区（位于2 616～147 nt），其中含有与双生病毒复制起始有关的保守序列TAATATTAC[19]（位于2 775～2 nt）。

BLAST结果显示，与HB01 DNAA序列有较高同源性的序列均为TYLCV分离物DNAA。进一步比较结果显示，HB01 DNAA与来自中国不同地区的TYLCV分离物的同源性均在97%以上，其中与来自上海（TYLCVSH2，AM282874）、浙江（TYLCVZJ3，AM698117）和安徽（TYLCVAHHB1，FN650807） 3个分离物DNAA的同源性最高，均为99.4%。

为了分析病毒分离物HB01与已报道的各TYLCV分离物的亲缘关系，本文选取了来自我国不同地区的12个分离物以及国外不同国家来源的19个TYLCV 代表分离物，以我国台湾番茄曲叶病毒白沙分离物（Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTWV，DQ237918）为外组构建系统进化树。从该系统进化树（图1）可以看出，HB01与来自中国不同地区的12个分离物及国外的11个分离物亲缘关系较近，聚在一个分支，进一步与来自科威特的KISR分离物形成一个大的分支；而与日本Mild [Tokai]分离物、西班牙Mild [Spain7297]分离物、留尼汪岛分离物、日本Sz分离物、阿巴代分离物、伊朗分离物及阿曼Tom48分离物等7个分离物的亲缘关系相对较远。

3讨论

虽然番茄黄化曲叶病已在我国上海、浙江、江苏、安徽、山东、河北、河南、天津、北京、吉林、陕西、广东、广西、福建、海南、云南、新疆、宁夏、重庆、辽宁、甘肃、四川等20多个省（市、自治区）相继发生，但对于湖北来说还是一个新病害。本文应用RCA方法从来自湖北的番茄病样中扩增获得病毒分离物HB01的全基因组序列，该序列与国际上已报道的TYLCV各分离物同源性均在89%以上，其中与来自我国其他地区的TYLCV分离物的同源率均在97%以上。因此，根据目前国际双生病毒分类方案[2]，确定侵染湖北番茄的病毒分离物HB01属于TYLCV的一个分离物，这是首次在湖北省检测到该病毒。

自2006年Wu等[4]首次报道TYLCV入侵我国以来，该病毒已扩散到我国20多个省（市、自治区），并造成严重损失。本研究通过比较病毒分离物基因组序列发现，我国各地分离物的同源性在97%以上。这说明：虽然该病毒入侵我国将近10年，但其种群的遗传依然比较稳定。当然，由于该病毒在田间与其他双生病毒存在复合侵染[20]，TYLCV是否会与其他病毒进行重组产生新株系或新病毒，还需要进一步监测。

近年来，湖北番茄栽培面积呈扩大趋势，尤其是高山番茄，市场效益好，发展迅速，面积逐年扩大，现已成为湖北省高山蔬菜高效栽培的主要品种之一。本研究首次在湖北番茄上发现番茄黄化曲叶病疫情，说明该病毒也开始入侵到湖北省，应引起有关部门和生产者的重视。积极采取有效的防范措施，预防与控制该病在湖北省传播、扩散和流行。

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（责任编辑：王音）