家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

摘要：【目的】建立针对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的环介导等温扩增（LAMP）可视化检测技术，为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持。【方法】以BmNPV多角体蛋白基因polh为扩增靶标，分别设计5组内/外引物和5条环引物，根据扩增效率筛选最佳引物组合；优化LAMP反应条件，并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验；使用羟基萘酚蓝（HNB）染色对结果进行比色观察，对简化样品处理的条件进行摸索。【结果】使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7 fg/μL，检测灵敏度得到有效提高，且反应时间缩短。建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性，对样本的检出率高于常规PCR，其最低检测限是常规PCR的100倍。在反应前加入HNB，结果易判断且能减少交叉污染。感染家蚕血淋巴进行100 ℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应，既简化了操作步骤，又降低了检测成本。【结论】针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点，适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断。

关键词： 家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；家蚕血液型脓病；LAMP；早期诊断；可视化

中图分类号： S884.51 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0163-06

Abstract：【Objective】The present study established loop-mediated isothermal amplification（LAMP） for visual detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）， in order to provide support for early diagnosis of nuclear polyhedrosis at work field. 【Method】Taking BmNPV polyhedrin gene polh as amplification target， five groups of inner primer/outer primer and five pieces of loop primer were designed in order to screen the best primer combination based on amplification efficiency. LAMP reaction conditions were optimized and assays on specificity， sensibility as well as clinical sample detection were conducted. The amplification result was observed by colorimetric determination with hydroxynaphthol blue （HNB） staining. The conditions for simplifying treatment were analyzed. 【Result】When using LAMP of loop primer， the lowest detection line of BmNPV genomic DNA could reach 7 fg/μl， the sensitivity of detection was improved effectively and reaction time was reduced. The established LAMP detection specifically amplified the target DNA， and its sample detection rate was superior to conventional PCR. The lowest detection line was as 100 times as that of conventional PCR. The result could be easily judged and the cross-contamination could be reduced by adding HNB before reaction. The hemolymph of infected silkworm boiled at 100 ℃ could be directly applied to LAMP， which could simplify operation steps and reduce detecting cost. 【Conclusion】The visual LAMP detection targeting BmNPV established in this study is sensitive， quick and reliable， which is appropriate to use for early diagnosis of BmNPV infection at work field.

Key words： Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）； nuclear polyhedrosis； LAMP； early diagnosis； visua-

lization

0 引言

【研究意義】家蚕血液型脓病是广西养蚕业中最常见及危害最严重的一种病毒性传染病，由于传染性强、病死率高，且目前尚无有效的治疗方法，对蚕茧生产造成巨大经济损失。家蚕血液型脓病病原为家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV），其特点是病毒粒子可在多角体结构的保护下长期保存感染活力，病毒多角体在自然环境中广泛富集，极易对桑叶和蚕作环境造成污染。BmNPV多角体被蚕体摄食后即引起原发性感染，继而传播感染蚕室内的其他健康蚕体（Fuxa，2004；Liang et al.，2013）。因此，建立针对BmNPV的特异、灵敏、快速、适合基层使用的可视化检测技术，对有效防控家蚕血液型脓病暴发流行及减少病毒多角体在生产环境中的富集具有重要意义。【前人研究进展】分子生物学诊断技术是近年来蚕病诊断研究的新方向，主要是基于聚合酶链反应（PCR）对病原微生物核酸进行扩增克隆。目前，国内已有关于BmNPV检测常规PCR（涂纳新等，1994；刘吉平等，2011；唐芬芬等，2013b）、实时荧光定量PCR（姚勤等，2005）、二温式PCR（覃玥和陈保善，2015）和多重PCR（专利号CN102605106A，浙江省检验检疫科学技术研究院）的研究报道；也有关于环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测技术的报道，但未涉及扩增效率的改善（唐芬芬等，2013a；覃玥等，2015）。本课题组通过对BmNPV多角体蛋白基因polh进行常规PCR扩增和测序分析，获得了广西多个毒株的polh基因序列信息（Liang et al.，2013），为LAMP的靶标选择和引物设计打下了基础。LAMP是一种操作简单、反应快速、高度特异和灵敏的核酸扩增技术（Nimitphak et al.，2000），自其问世以来，经过不断的优化和改进，目前已广泛应用到不同领域的生物基因检测及鉴别研究，如畜禽病原微生物LAMP检测方法的建立为生产现场的快速诊断提供了技术支持（Liu et al.，2011；彭宜等，2013；Pawar et al.，2014；Xie et al.，2014；邓显文等，2015；胡成等，2015；潘宏等，2015）。【本研究切入点】目前生产上对家蚕血液型脓病的诊断主要依靠典型病征的肉眼观察诊断，但BmNPV感染家蚕后的病程与家蚕龄期、病毒数量和毒力、饲养环境及家蚕体质等因素有关，且该病为亚急性传染病，可确诊时期通常已发展到感病晚期，因此亟需建立一种特异、灵敏、快速、适合基层使用的可视化检测技术。【拟解决的关键问题】建立针对BmNPV的LAMP检测技术，为生产开展家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持，及时发现病情并采取有效防治措施，控制该病的扩散传播。