多层纸芯片乳腺癌组织微阵列用于抗肿瘤药物测试

材料组装形成复合的立体组织结构是一种简便有效的组织构建方法。已有文献报导了利用不同类型多孔平面材料，如电纺丝膜、聚合物薄膜和蚕丝蛋白薄膜等作为细胞载体[12～15]。在这些研究中，首先将不同类型细胞分别培养在多层薄膜上，继而通过叠加简便地实现组织的仿真。2009年，哈佛大学的Martinez等[16]在多层组装组织构建技术的基础上，提出“纸芯片”细胞培养和分析技术。该技术在微流控芯片中使用通透性薄膜材料（如纸、纤维膜以及聚合物薄膜等）作为分子扩散的媒介以及细胞培养的支撑， 自提出以来，纸芯片技术得到快速发展，纸和薄膜材料也在细胞培养中得到了初步应用并取得良好效果。张琼等[17]用明胶处理的硝酸纤维素薄膜模拟基底膜，支撑肝癌细胞3D培养，显示出极好的仿真性能。Derda等[18]报导了使用多层折叠纸材料作为3D细胞培养的支架，结果显示多层纸芯片3D培养可以真实模拟体内生理状态。之后，该研究组又使用喷蜡打印技术，发展了高通量3D纸芯片细胞培养技术[19]。从上述研究工作可以看出，纸芯片细胞培养技术不仅可以简便地实现组织仿真，而且其可拆解特性便于从空间角度反映肿瘤组织不同层面细胞对于微环境因素的反应。

本研究提出了一种多层纸芯片3D肿瘤微阵列用于抗肿瘤药物反应测试。以纸材料作为细胞培养的支撑，以聚碳酸酯（Polycarbonate，PC） 微孔薄膜仿真血管内皮屏障，将PC膜与接种有肿瘤细胞的图形化多层纸叠加构建仿真乳腺癌组织。借助于纸材料中的分子扩散，模拟体内的物质运输形式建立浓度梯度介导的细胞药物相互作用机制。这种纸芯片的最大特色是可以通过纸层的拆分，简便地实现肿瘤结构3D2D转换。通过检测各层面上细胞生存和代谢情况，可以从空间上解析不同层面上肿瘤细胞对于药物刺激的反应。本研究以MDAMB231乳腺癌细胞株为模型构建组织阵列，并利用这种仿真芯片肿瘤组织获取癌细胞对于药物刺激的反应等信息。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

IX71倒置荧光显微镜，AU2700全自动生化分析仪（日本Olympus公司）；GUAVA easyCyte HT流式细胞仪（德国Merck公司）；喷蜡打印机（富士施乐8560DN）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）前体及引发剂（美国Dow Coming公司）；PC薄膜（孔径200 nm） 和Grade114滤纸（英国Whatman公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、DMEM培养基、明胶、胰蛋白酶溶液、RNase A （美国ThermoFisher公司）；海藻酸钠、CaCl2、碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）购自上海生工公司；钙黄绿素AM（CalceinAM，日本Dojindo公司）；盐酸阿霉素（深圳万乐药业有限公司）；荧光染料和阿霉素用二甲基亚砜配制，荧光染料使用前用PBS稀释为工作液，其中CalceinAM/PI两种染料含量分别为1.0 mol/L和1.5 mol/L。乳腺癌细胞株MDAMB231由中科院广州生物医药与健康研究院提供。实验用水为二次蒸馏水。

2.2 纸芯片加工

纸芯片加工参考文献[20]的方法。每张芯片包含一个8×5亲水点阵，每个亲水点直径为4 mm，亲水点间距为 2 mm。芯片图案用喷蜡打印机在滤纸上打印出来（打印分辨率为2400 dpi × 2400 dpi），之后将滤纸在150℃烘烤2 min。滤纸表面的蜡在烘烤过程中熔化并渗透滤纸全层，形成封闭的亲水区域限定细胞图形化生长。在顶层滤纸的亲水区打孔，底面用双面胶封接一层微孔PC薄膜（孔径0.1 μm）。滤纸的细胞接种区使用0.1%明胶处理，烘干后备用。

2.3 细胞培养

乳腺癌细胞MDAMB231首先在培养皿中培养，待增殖至80%覆盖率时使用0.25%胰蛋白酶EDTA溶液消化。收获的细胞洗涤2次后，MDAMB231细胞悬液与同体积的2.0%海藻酸钠溶液混匀制成浓度为1.5×107/mL的细胞悬液。

2.4 纸芯片上细胞的接种与培养

纸芯片在使用前用紫外线照射消毒。多层纸芯片的14层的每个亲水区接种1.5 × 105个细胞，之后滴加3 μL CaCl2溶液。静置2 h后将接种了细胞的纸芯片折叠，用订书机将折叠滤纸的两端装订起来。折叠纸芯片放置于尺寸为60 mm×9 mm×2 mm的长方形PDMS孔板中（图1），加入培养基覆盖。培养过程中隔天换液。

图1 A.芯片加工和实验操作流程示意图。（i）滤纸喷蜡打印后烘烤，得到8×5亲水点阵；（ii）在首行亲水区打孔并用双面胶封接一层微孔PC薄膜；（iii）在其余4行亲水区接种乳腺癌细胞；（iv）滤纸折叠后两端用订书机装订，放入培养池中浸泡培养；B. 多层纸芯片仿真乳腺癌组织；C. 喷蜡打印加工纸芯片实物图；D. 纸芯片折叠后置于培养池中浸泡培养。

2.5 纸芯片培养细胞分析

培养2， 4， 7天后，将多层纸芯片取出、展开， CalceinAM/PI染色后，用荧光显微镜观察每层细胞的形态和荧光显色情况。CalceinAM可透过细胞膜，进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Calcein，发出强绿色荧光 （激发波长490 nm，发射波长515 nm），因此CalceinAM仅对活细胞染色。PI仅能穿过死细胞膜到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光 （激发波长535 nm，发射波长617 nm）。由于Calcein和PIDNA都可被490 nm激发光激发，因此可用荧光显微镜根据不同颜色的荧光同时观察活细胞和死细胞。用Photoshop软件分别统计红色和绿色荧光覆盖面积（S），细胞生存率=S绿/（S绿+S红） ×100%。

在培养2， 4， 7天后，将多层纸芯片取出、展开，并用剪刀将纸芯片分别剪开并放到装有生理盐水的试管中。待水凝胶溶解后，分别将各层滤纸收集到1.5 mL离心管，用胶原酶和胰酶消化并收集细胞，用PBS洗1次后，用预冷的70%乙醇重悬细胞，4℃放置30 min固定细胞。PBS再次洗涤1次后，加入RNase A （100 μg/mL），37℃放置30 min去除RNA，之后加入PI（10 mg/μL）染色15 min，流式细胞仪检测并用Modfit软件分析得出细胞周期分布。同时，制备等量细胞悬液放入一个含200 μL细胞裂解液的离心管，剧烈振荡，以1000 r/min离心3 min后，用全自动生化分析仪检测各层细胞的胞内乳酸含量。

2.6 抗肿瘤药物盐酸阿霉素测试

在细胞接种后第二天，更换含有不同浓度盐酸阿霉素的新鲜培养基。培养24 h后取出滤纸，CalceinAM/PI染色， 荧光显微镜下观察并拍照，计算每层细胞存活率。同时，以96孔板培养细胞作为2D组对照实验。

3 结果与讨论

3.1 纸芯片上乳腺癌组织的构建

本研究利用喷蜡打印技术加工图形化纸芯片构建高密度肿瘤细胞阵列。纸芯片折叠后用孔径0.1 μm微孔PC薄膜覆盖，用以构建仿真肿瘤组织。多层纸材料支撑3D培养乳腺癌细胞模拟肿瘤实质，纸芯片肿瘤组织表面的微孔薄膜模拟血管内皮层，包裹细胞的水凝胶模拟细胞外基质，而明胶处理纸纤维模拟肿瘤间质。因此，多层纸芯片乳腺癌组织允许在高度仿真的条件下进行体外抗肿瘤药物测试。这种多层纸芯片乳腺癌组织的最大优势在于可以通过拆解简便地实现组织结构从3D至2D的转化，从而可以从空间角度解析肿瘤组织内部细胞形态、结构和功能变化。

3.1.1 乳腺癌组织实质的模拟 滤纸孔隙中的乳腺癌细胞由于受空间限制得以维系3D 排列形式。荧光显微镜成像（图2A）显示，滤纸上细胞团散的分布，提示乳腺癌细胞聚集形成类似实体瘤的肿瘤球结构。Photoshop软件分析结果显示（图2B），随着培养时间的延长，各层滤纸的荧光强度逐渐增强，表明培养细胞的增殖。

图2 多层滤纸上的乳腺癌细胞培养

Fig.2 Breast cancer cells cultured on multilayer paper chip

（A） 培养不同时间后纸芯片各层乳腺癌组织CalceinAM/PI染色荧光图 （放大倍数4×10，标尺100 μm）；B. Photoshop软件分析得到的各层乳腺癌组织的荧光强度动态变化曲线；C. 纸芯片乳腺癌组织的CalceinAM/PI荧光染色局部放大图显示细胞团的形成 （放大倍数10×10）。

3.1.2 乳腺癌组织间质的模拟 纸材料为多孔纤维素结构，具有良好的生物兼容性。本实验使用明胶处理滤纸纤维，模拟肿瘤间质，对乳腺癌细胞起到支持、连接、保护和营养作用。接种细胞悬液中混有一定浓度的海藻酸钠，当接触Ca2+时固化成水凝胶包裹细胞，功能类似于细胞外基质。实验使用海藻酸钠浓度为2.0%，可以为细胞生长提供适宜的间质硬度。海藻酸钠和明胶中含有选择素和整合素成分，可以提供细胞结合位点[21]，促使乳腺癌细胞通过粘附分子与间质成分之间建立联系。

3.1.3 乳腺癌组织微血管扩散屏障的模拟 在肿瘤组织中，细胞与外界的物质交换通过血管内皮层、组织间质和细胞外基质扩散而实现。在多层纸芯片肿瘤组织内，物质运输依赖于被动扩散因而形成了各种物质成分在细胞整个扩散路径内的浓度梯度分布，模拟了体内微环境。据文献[22]报道，由于物质扩散屏障的存在，体内肿瘤组织与外界物质交换效率远低于体外培养。实验在纸芯片肿瘤组织中以孔径0.1μm多孔PC薄膜仿真血管内皮，以纸纤维和水凝胶模拟组织间质和细胞外基质，以3D肿瘤球模拟肿瘤实体结构，这样就构建了从微血管到肿瘤细胞的完整扩散屏障。

由于扩散屏障的存在，肿瘤组织内处于缺氧状态，而细胞的代谢主要依赖糖酵解，因而会产生乳酸蓄积[ 23]。实验结果表明，多层纸芯片乳腺癌组织内细胞内乳酸水平随着培养时间的延长而增加（图3），因此非常接近于体内肿瘤组织的酸化状态[24]。

3.2 多层纸芯片乳腺癌组织中的细胞生存和增殖

连续监测接种后7天内的细胞存活率和细胞周期分布实验结果如图4所示。随着培养时间的延长，细胞存活率缓慢降低，至第4天时稳定在80%左右（图4A）。在相同时间点，各层滤纸上的细胞存活率无明显差异。如图4B所示，随着时间延长，纸芯片肿瘤组织中增殖细胞比例逐渐降低。在第2天时，增殖细胞比例在1层和2层滤纸中约为20%，3层和4层滤纸中分别为30%和50%； 4天以后，各层的增殖细胞比例均降至15%以下。与2D培养组相比较，多层纸芯片肿瘤组织内增殖细胞比例显著降低（15% vs 60%），这符合体内肿瘤细胞的增殖动力学。

3.3 多层纸芯片乳腺癌组织对于阿霉素刺激的反应

如图5所示，多层纸芯片乳腺癌组织中的细胞存活率随着阿霉素浓度升高而降低。相比之下，芯片培养细胞的效应剂量曲线要平缓得多。IC50值在2D组和芯片组分别为1.14和5 μmol/L（预测）。阿霉素浓度升高至0.5 μmol/L以上时，显现出较强的细胞毒性。用相对存活率（R=药物刺激细胞存活率/同层非药物刺激细胞存活率 × 100%）反映细胞对于药物刺激的反应，则有 R3>R2>R4>R1。上述结果提示多层纸芯片乳腺癌组织对于阿霉素具有较强的抵制，这解释了为何实体瘤化学治疗效果普遍不佳[25]。这种药物抵制效应在深层组织更为显著[26]，分析其原因可能为由于扩散屏障的存在，药物运输效率受到限制，此外由于组织内部的缺氧和微环境酸化，削弱了药物的疗效。

4 结 论

本研究开发了一种多层纸芯片细胞培养平台。将乳腺癌细胞分别接种于多层的图形化纸芯片的亲水区，折叠后构建了仿真实体肿瘤。结果显示，各层纸芯片培养的乳腺癌细胞存活率均保持在80%以上，并形成了类组织结构。芯片乳腺癌组织内部呈酸化倾向，且酸化程度随着培养时间的延长而升高。与2D二维（2D）培养细胞相比较，纸芯片乳腺癌组织内细胞增殖比例显著降低。多层纸芯片乳腺癌组织显示了更加接近体内情况的药物反应机制，细胞存活率随阿霉素浓度升高呈现缓慢下降趋势，IC50值显著高于2D培养细胞组。本研究的实验结果表明，基于多层纸芯片肿瘤阵列的抗肿瘤药物测试操作简便、仿真性高，是体外药物测试的有力工具。

References

1 Hatok J， Babusikova E， Matakova T， Mistuna D， Dobrota D， Racay P. Clin. Exp. Med.， 2009， 9（1）： 1-7

2 Damia G， Garattini S. Cancer Treatment Rev.， 2014， 40（8）： 909-916

3 Li X Y， Hu S Q， Xiao L. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci.， 2015， 19（11）： 2112-2119

4 Kimlin L， Kassis J， Virador V. Expert Opin. Drug Discov.， 2013， 8（12）： 1455-1466

5 Greek R， Menache A. Int. J. Med. Sci.， 2013， 10（3）： 206-221

6 Mroue R， Bissell M J. Methods Mol. Biol.， 2013， 945： 221-250

7 Nam K H， Smith A S， Lone S， Kwon S， Kim D H. J. Lab. Autom.， 2015， 20（3）： 201-215

8 Van D V， Trietsch S J， Joore J， Vulto P， Hankemeier T. Curr. Opin. Biotechnol.， 2015， 35： 118-126

9 SchreiberBrynzak E， Klapproth E， Unger C， LichtscheidlSchultz I， Gschl S， Schweighofer S， Keppler B K. Invest. New Drugs.， 2015， 33（4）： 835-847

10 Hirschhaeuser F， Menne H， Dittfeld C， West J， MuellerKlieser W， KunzSchughart L A. J. Biotechnol.， 2010， 148（1）： 3-15

11 Kimura H， Ikeda T， Nakayama H， Sakai Y， Fujii T. J. Lab. Autom.， 2015， 20（3）： 265-273

12 Wang X， Kim H J， Xu P， Matsumoto A， Kaplan D L. Langmuir， 2005， 21（24）： 11335-11341

13 Matsuzawa A， Matsusaki M， Akashi M. Langmuir， 2012， 29（24）： 7362-7368

14 Sailer M， Sun K L W， Mermut O， Kennedy T E， Barrett C J. Biomaterials， 2012， 33（24）： 5841-5847

15 Catros S， Guillemot F， Nandakumar A， Ziane S， Moroni L， Habibovic P， Fricain J C. Tissue Eng. Part C： Methods.， 2011， 18（1）： 62-70

16 Martinez A W， Phillips S T， Whitesides G M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 2008， 105（50）： 19606-19611

17 ZHANG Qiong， ZHOU XiaoMian， YAN Wei， LIANG GuangTie， ZHANG QiChao， LIU DaYu. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（7）： 996-1001

张 琼， 周小棉， 严 伟， 梁广铁， 张其超， 刘大渔. 分析化学， 2012， 40（7）： 996-1001

18 Derda R， Laromaine A， Mammoto A， Tang S K， Mammoto T， Ingber D E， Whitesides G M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.， 2009， 106（44）： 18457-18462

19 Derda R， Tang S K， Laromaine A， Mosadegh B， Hong E， Mwangi M，Mammoto A， Ingber D E， Whitesides G M. PLoS One， 2011， 6（5）： e18940

20 Lu Y， Shi W， Qin J， Lin B. Anal. Chem.， 2009， 82（1）： 329-335

21 YAN Wei， ZHANG Qiong， CHEN Bin， LIANG GuangTie， LI WeiXuan， ZHOU XiaoMian， LIU DaYu. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（6）： 822-827

严 伟， 张 琼， 陈 斌， 梁广铁， 李伟萱， 周小棉， 刘大渔. 分析化学， 2013， 41（6）： 822-827

22 Lee J S， Romero R， Han Y M， Kim H C， Kim C J， Hong J S， Huh D. J. Matern Fetal. Neonatal Med.， 2015： 1-9

23 Vander Heiden M G， Canfley L C， Thompson C B. Science， 2009， 324（5930）： 1029-1033

24 Parks S K， Chiche J， Pouyssegur J. J. Cell Physiol.， 2011， 226（2）： 299-308

25 Nolte D D， An R， Turek J， Jeong K. Biomed. Opt. Express.， 2012， 3（11）： 2825-2841

26 Elliott N T， Yuan F. J. Pharm. Sci.， 2011， 100（1）： 59-74

AntiCancer Drug Testing Using MultiLayer PaperSupported

Breast Cancer Tissue Array

LIU WeiPing1， LIN JinQiong1， DU Yan1， QI MingYue1， LIANG GuangTie1，2， YANG Na1，2， LIU DaYu*1，2，3

1（Department of Laboratory Medicine， Guangzhou First People′s Hospital，

Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510180， China）

2 （Clinical Molecular Medicine and Molecular Diagnosis Key Laboratory of Guangdong Province， Guangzhou 510180， China）

3 （Clinical Research Center， the Second Hospital Affiliated to Dalian Medical University， Dalian 116027， China）

Abstract This paper describes a multilayer papersupported breast cancer tissue array. The paperbased microchip with arrayed hydrophilic spots was fabricated by wax printing. After cell seeding， the microchip was folded to form an artificial solid tumor， and the multilayer paper was covered by a layer of microporous membrane that mimics endothelial layer. After culturing the papersupported breast cancer tissue for a certain period of time， the multilayer device was unfold thus enabling detections of cell survival， proliferation， morphology and metabolism on different layers. Breast cancer cells cultured on paper had a survival rate >80% and aggregated into tumor spheroids. Intracellular lactic acid levels increased with the extension of culture time. Compared to two dimensional （2D） counterparts， the decreased fraction of S phase cell （15% vs 60%） was detected. The papersupported breast cancer tissue showed a drug response mechanism similar to the tumor in vivo. Cancer cells within the tissue were less sensitive to doxorubicin and the IC50 value detected was significantly higher than that obtained with 2D cultures （5 μmol/L vs 1.14 μmol/L）. The multilayer papersupported breast cancer tissue array developed in this work featured simple tissue reconstruction and easy operation， thus providing an ideal tool for anticancer drug testing.

Keywords Paperbased microfluidic chip； Breast cancer； Tissue microarray； Microenvironment； Anticancer drug

（Received 30 December 2015； accepted 29 February 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 81371649， 81271730， 81171418） and the Medicine Health Science and Technology Program of Guangzhou （Nos. 20121A021002， 20121A011035）