仙茅及其有效成分对不同状态L02细胞PXR—CYP3A的影响研究

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[摘要] 目的：明确仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷对正常、虚寒状态L02细胞中PXR-CYP3A的影响，为探讨仙茅在不同状态下药效表达差异的机制奠定基础。方法：分别用正常、虚寒大鼠血清培养L02细胞，诱导正常、虚寒2种状态细胞。仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷作用于不同状态细胞后，检测不同状态L02细胞PXR蛋白表达和CYP3A活性。结果：MTT法结果显示，仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷能使L02细胞活力明显增强；仙茅水提液能使正常组L02细胞PXR蛋白表达水平显著降低，苔黑酚葡萄糖苷能使正常组L02细胞CYP3A活性和PXR蛋白表达水平均显著降低；而仙茅水提液能使虚寒组L02细胞CYP3A活性和PXR蛋白表达升高，苔黑酚葡萄糖苷能使虚寒组L02细胞CYP3A活性水平显著降低，使虚寒组细胞PXR蛋白表达水平升高。结论：仙茅作用于虚寒状态L02细胞，能激活PXR诱导CYP3A活性，但对正常L02细胞的PXR及其介导的CYP3A活性没影响或作用相反。

[关键词]仙茅；有效成分；L02细胞；孕烷X受体；药物代谢酶CYP3A

孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR）是核受体亚家族的主要成员之一，因为能被多种天然的或合成的孕激素所激活而得名。PXR对机体内环境的稳态起着重要调节作用，并对多种药物代谢酶、转运体及其他基因表达有调控作用。CYP3A是影响药物体内过程的重要代谢酶，PXR对CYP3A的调控受到了学者们的高度关注。随着人们对中草药研究的不断深入，中药或其成分对PXR-CYP3A的影响研究不断增多^[1-5]。但从体外细胞水平研究中药或其有效成分对PXR和CYP3A的影响少见，特别是对不同状态细胞的影响尚未见报道。本实验排除机体复杂因素影响，将仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷分别作用于正常和虚寒状态L02细胞，观察仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷对不同状态L02细胞PXR及其介导的CYP3A变化的影响，从体外实验探讨仙茅药效表达机制。

1材料

1.1动物与细胞 雄性SD大鼠，体重（240±10） g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2007-0001。L02细胞：即正常人肝细胞，由北京中医药大学中药学院生物技术系王春梅老师惠赠。

1.2药物和试剂 仙茅药材和苔黑酚葡萄糖苷对照品由北京中医药大学中药分析系的黄建梅教授提供，苔黑酚葡萄糖苷对照品纯度>95%。注射用氢化可的松琥珀酸钠（天津生物化学制药有限公司，批号20100102）。RPMI Medium 1640 培养基（31800-014）、胰酶、胎牛血清（美国GIBCO公司）；台盼蓝、MTT（美国Sigma公司）；红霉素、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）生成系统（包括NADP，6-磷酸葡萄糖二钠，6-磷酸葡萄糖脱氢酶）为Sigma产品；牛血清蛋白（北京邦定泰克生物技术公司）。丙烯酰胺（电泳级）、双丙烯酰胺（N-N′-甲叉双丙烯酰胺）、过硫酸胺、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯即吐温-20（Amresco）；Tris，Base[三（羟甲基）氨基甲烷]，SDS（十二烷基磺酸钠）（Sigma公司）；TEMED（Aldrich）；甘氨酸（Glycine，北京拜耳迪生物公司）；2-巯基乙醇、Triton X-100（Topbio）；PMSF、丽春红（北京生科泰园）；NC膜（Amersham Biosciences）；Μltra ECL底物化学发光检测试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）；PXR（H-160）：sc-25381 Antibod，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY；HRP Conjugated Goat Anti-rabbit IgG（h+1）：GGHL-15P，Immunology Consultants Laboratory；ACTB MonoClonal Antibody （mouse），Protein tech Group；HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L），Protein tech Group。

1.3仪器 CO2细胞培养箱（美国Napco公司）；超净工作台（天津医药净化设备厂）；YG500圆筒型不锈钢过滤器；Nikon生物显微镜（日本）；SHIMADZU UV-120-02紫外-可见分光光度计（型号752，上海光谱仪器有限公司）；LXJ-Ⅱ离心机（上海医用分析仪器厂）；EB-280-22电子精密天平（日本CORPORATION公司）； DIAX900型内切式匀浆器（德国Hei dolph公司）；电泳仪、Trans-Blot转印槽（BIO-RAD公司）；移液器（Eppendorf公司）；spectraMax 190酶标仪（美国分子仪器公司）；Neofuge23R高速冷冻台式离心机（HealForce公司）。

2方法

2.1正常/虚寒大鼠血清制备 SD雄性大鼠20只，按体重随机分为2组，即正常组和虚寒模型组，每组10只。虚寒组每天早晨后腿肌注20 mg·kg^-1的氢化可的松琥珀酸钠（生理盐水溶解），正常组肌注等体积生理盐水，连续14 d。第14天肌注后每组大鼠用2%戊巴比妥钠麻醉后腹主静脉取血，离心，分离血清，将同组血清合并后，56 ℃水浴灭活30 min，用0.20 μm的滤器过滤除菌后，置-80 ℃冰箱保存备用。

2.2L02细胞培养 从液氮罐中迅速取出冻存的L02细胞株，复苏，用含10%FCS，100 U·mL^-1青霉素，100 U·mL^-1链霉素的1640培养基培养，置37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。细胞为单层贴壁生长，24 h后细胞贴壁更换培养基，当细胞贴壁大于85%时（对数生长期）即可传代。

2.3MTT法检测不同浓度仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷对L02细胞活性的影响 细胞传至状态较好时，调整细胞浓度，接种于96孔板，每孔体积100 μL，约4 500个细胞。培养1 d后，待细胞贴壁，吸出原培养基，加入含药培养基，加不含药培养基为对照，仙茅水提液设6个浓度梯度（800，600，400，200，100，50 mg·L^-1），苔黑酚葡萄糖苷设7个浓度梯度（1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8，1×10^-9 mol·L^-1），每孔加200 μL，每个梯度设6个复孔，培养48 h后，每孔加MTT溶液（5 g·L^-1，用PBS配制，pH 7.4）20 μL。继续孵育4 h，终止培养，小心倒掉孔内培养液。每孔加150 μL DMSO，微量振荡器振荡10 min，使结晶物充分溶解，选择570 nm波长，酶标仪测定各孔吸光度。

2.4细胞分组与处理 细胞状态较好时，调整细胞浓度，接种于6孔板，每孔含25×104个细胞。培养24 h后，待细胞贴壁，吸出原培养基。将6孔板分成正常大鼠血清组、虚寒大鼠血清组、正常大鼠血清+仙茅组、虚寒大鼠血清+仙茅组、正常大鼠血清+苔黑酚葡萄糖苷组、虚寒大鼠血清+苔黑酚葡萄糖苷组，共6组，每组3孔，正常组加含10%的正常大鼠血清培养基，虚寒组加含10%的虚寒大鼠血清培养基（2组均含100 U·mL^-1青霉素，100 U·mL^-1链霉素），仙茅水提液给药浓度为生药0.6 g·L^-1，苔黑酚葡萄糖苷给药浓度为1×10^-5mol·L^-1，培养48 h，收集细胞，待测。

2.5L02细胞中CYP3A活性检测 小心吸去培养液，PBS洗2次，加1 mL PBS，用细胞刮刀刮下细胞后，将细胞混悬液5 000 r·min^-1离心10 min，小心吸出上清，每管加200 μL pH 7.4的甘油磷酸缓冲液，制成细胞悬液，并用超声细胞破碎仪破碎细胞，再3 000 r·min^-1，4 ℃，离心15 min，轻轻吸出上清备测CYP3A活性，检测方法见文献[6]。

2.6L02细胞中PXR蛋白水平检测 小心倾去培养基，加PBS液1 mL洗3次后，加PBS液0.8 mL（2次），用细胞刮刀轻轻刮下细胞，1 000 r·min^-1离心10 min，轻弃上清，用小枪头轻轻吸掉残留液体，加100 μL蛋白裂解液（每1 mL加100 mmol·L^-1的PMSF 10 μL），冰上裂解30 min以上。最后12 000 r·min^-14 ℃离心10 min。吸出上清到新预冷的离心管，-80 ℃冰箱保存待测。蛋白定量，每孔上样12 μL，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法分离蛋白，进行转膜、PXR抗原抗体反应、内参actin抗原抗体反应、显色、曝光，扫描胶片，用Bio-Rad quantity one 软件进行分析，PXR表达水平用目标条带灰度与内参actin条带的灰度比值定量表示。

2.7统计学处理 实验数据采用SAS 8.2统计软件分析，结果以±s表示，2组间均数比较采用t检验；组间比较采用ANOVA方差分析。

3结果

3.1不同浓度仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷对L02细胞活性的影响 与空白对照组比较，仙茅水提液各浓度对L02细胞活力均有增强作用，差异显著（P<0.01或P<0.05），而仙茅有效成分苔黑酚葡萄糖苷高浓度（1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5 mol·L^-1）时对L02细胞活力有明显增强作用（P<0.05），低浓度（1×10^-6， 1×10^-7， 1×10^-8， 1×10^-9 mol·L^-1）时增强作用不明显，结果见表1。

表1 不同浓度仙茅水提液、苔黑酚葡萄糖苷对细胞活力影响（±s，n=6）

Table 1 Influence of water decoction of Curculiginis Rhizoma and orcinol glucoside on cell viability（±s，n=6）

3.2各组细胞CYP3A活性变化 与正常组比较，虚寒组细胞CYP3A活性有降低趋势；仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷作用于正常组细胞后，CYP3A活性均降低，苔黑酚葡萄糖苷组降低显著（P<0.01）；仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷作用于虚寒组细胞后，仙茅水提液能使虚寒组细胞降低的CYP3A活性升高，但无统计学意义，而苔黑酚葡萄糖苷组能使虚寒组细胞降低的CYP3A活性降的更低，差异显著（P<0.01），结果见表2。

3.3各组细胞PXR蛋白水平变化 与正常组细胞相比，虚寒组细胞PXR蛋白表达水平显著降低（P<0.05），仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷作用于正常组细胞后，二者均能使正常细胞PXR蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷作用于虚寒组细胞后，与虚寒组细胞相比，虚寒+仙茅水提液组细胞PXR蛋白表达水平有升高趋势，但无统计学意义；虚寒+苔黑酚葡萄糖苷组细胞PXR蛋白表达水平变化不明显，结果见表3，图1。

4讨论

L02细胞来源于人正常肝组织，具有与正常肝细胞相似的生物功能。有学者将L02细胞应用于多药耐药相关蛋白^[7-8]及药物代谢酶^[9]的研究，但应用于PXR和CYP3A研究的报道相对较少。课题组李敏基于L02细胞开展cAMP-PKA信号通路对CYP3A的调控研究^[10]，探讨辛热药药性表达^[11]，并建立了L02细胞中CYP3A活性的检测方法。目前，用不同处理血清建立体外细胞病理模型的研究逐渐受到广大研究者的重视，但用动物模型血清培养细胞模拟病理状态的研究尚未见报道。本研究在发现正常、虚寒状态大鼠PXR蛋白表达和CYP3A活性存在差异的基础上，分别用正常、虚寒大鼠血清培养L02细胞，建立体外虚寒状态细胞模型，并已发现不同血清培养的L02细胞PXR蛋白表达和CYP3A活性不同，与整体动物表现一致。可见，选用L02细胞作为体外细胞研究中药对不同状态细胞PXR和CYP3A的影响是可行的。

辨证论治是中医临床的核心，是指导中医诊疗的灵魂。研究中药不能脱离与之相对应的证候。机体不仅是药物作用的对象，也是药物发挥效应的载体，还是功效产出的依托。同一药物作用于不同机体状态，所表现出的生物学效应是不同的。本研究引入的示例辛热药仙茅是一味传统的补肾壮阳中药，针对仙茅的性效特点，其主要用于治疗虚寒证。前期实验已观察到仙茅作用于正常、虚寒2种不同状态大鼠的生物学效应存在差异，并且对PXR和其下游调控的CYP3A的作用亦不同。本研究选用不同状态L02细胞，观察仙茅对不同状态细胞PXR和CYP3A影响。从而体内外实验相互映证，探讨仙茅对正常、虚寒不同状态下PXR和CYP3A变化的影响。

细胞毒实验结果显示，仙茅及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷对L02细胞没有明显细胞毒作用。用正常和虚寒大鼠血清培养L02细胞，虚寒组细胞的CYP3A活性和PXR蛋白表达水平均降低，其中PXR蛋白表达水平显著降低。仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷分别作用于正常组细胞后，前者能使正常组细胞PXR蛋白表达水平显著降低；后者能使CYP3A活性和PXR蛋白表达水平均显著降低。仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷分别作用于虚寒组细胞后，前者能使虚寒组细胞CYP3A活性和PXR蛋白表达升高；后者能使虚寒组细胞CYP3A活性水平显著降低，而能使虚寒组细胞PXR蛋白表达水平升高。

本研究基于临床用药实际，探讨不同状态下仙茅药效表达差异的可能机制。从体外细胞层面验证了正常、虚寒状态下仙茅药效差异可能与PXR及其介导的CYP3A有关。为进一步仙茅药效表达机制研究提供了实验基础。

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[11] 李敏，张冰，刘小青.基于L02细胞CYP3A变化的辛热药附子、仙茅药性表达研究[J].中华中医药杂志，2010，25（12）：2351.

Study on effect of Curculiginis Rhizoma and its active ingredient on

PXR-CYP3A of L02 cells in different states

XUE Chun-miao1， ZHANG Bing2*， LIN Zhi-jian2

（1. Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China；

2. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract] Objective： To define the effect of Curculiginis Rhizoma and its active ingredient orcinol glucoside on PXR-CYP3A of L02 cells in normal and deficiency-cold states， in order to lay a foundation for studies on the mechanism of efficacy expression differentiation of Curculiginis Rhizoma in different states. Method： Serums of normal and deficiency-cold rats were adopted to culture L02 cells and induce cells in normal and deficiency-cold states. After aqueous extracts from Curculiginis Rhizoma and its active ingredient orcinol glucoside were used in cells in different states， PXR protain expression and CYP3A activity of L02 cells in normal and deficiency-cold states were observed. Result： MTT results showed that aqueous extracts from Curculiginis Rhizoma and orcinol glucoside could significantly enhance viability of L02 cells. Aqueous extracts from Curculiginis Rhizoma could significantly reduce PXR protein expression of L02 cells in normal state， while orcinol glucoside could significantly reduce CYP3A activity and PXR protein expression of L02 cells in normal state. Meanwhile， aqueous extracts from Curculiginis Rhizoma could significantly increase CYP3A activity and PXR protein expression of L02 cells in deficiency-cold state， while orcinol glucoside could significantly reduce CYP3A activity and increase PXR protein expression of L02 cells in deficiency-cold state. Conclusion： Curculiginis Rhizoma can activate PXR and induce CYP3A activity of L02 cells in deficiency-cold state， but with no effect or even counteraction on PXR and its induced CYP3A of L02 cells in normal state.

[Key words] Curculiginis Rhizoma； active ingredient； L02 cell； PXR； CYP3A

doi：10.4268/cjcmm20131926