bFGF基因体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞研究

【摘要】目的:用Lipofectamine转染试剂介导,将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞,检测转染效果及目的基因的表达情况。材料与方法:抽取临床确诊缺血性心肌病患者髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨髓基质干细胞。绘制生长曲线。MTT比色法检测细胞活力。取第二代细胞,使用Lipofectamine转染试剂,将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF转染骨髓基质干细胞,转染后4h、12h、24h、48h、72h以及传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达效率及荧光强度的变化,计算转染效率。取各观察时间点的培养上清液,酶联免疫吸附试验检测其中bFGF的浓度。转染细胞爬片行bFGF免疫组化染色检测bFGF的表达。结果:缺血性心肌病患者基质干细胞在接种后24小时开始贴壁,伸展成长梭形。MTT比色法测细胞活力达96%。在不同时间点观测EGFP表达情况,发现在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在48h达高峰,72h时可见部分细胞荧光强度下降,传代后仍可观察到EGFP的表达。ELISA检测不同时间点转染上清液中分泌的bFGF浓度,结果在4h-48h内浓度呈渐进上升的趋势,在48h最高可达23.5ng/ml。转染后的部分细胞形态发生变化。转染细胞爬片行bFGF免疫组化染色证实在胞浆中有bFGF颗粒着色阳性。结论:使用Lipofectamine转染试剂可有效地转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞。转染后的培养上清可在较长时间内检测到较高浓度的bFGF的分泌。bFGF基因转染可促进骨髓基质干细胞的增殖、分化。

【关键词】基质干细胞;碱性成纤维细胞生长因子;缺血性心肌病;转染

doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.09.088文章编号:1006-1959(2010)-09-2378-02

骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)是在骨髓中存在的一类具有多向分化潜能的细胞总称,在成体动物中仍具有在特定条件下向特定组织分化的能力。正是由于骨髓基质干细胞具有向多种细胞分化的可能,并且在体外扩增迅速、来源广泛等优点,因此便成为组织工程法修复各种病损的理想种子细胞,但将其作为基因治疗的靶细胞的研究较少。它在骨髓中仅占0.25%,在成年机体中约占有核细胞的十万分之一。本实验通过脂质体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞,观察目的基因和标记基因在BMSCs中的表达情况,并观测转染对其生长增殖及表型所带来的影响。

1.材料与方法

1.1骨髓基质干细胞的体外单层培养及生长特性的检测。随机选取临床确诊为缺血性心肌病的患者,征得患者同意后,在局部麻醉下用肝素预处理过的骨髓穿刺针于髂嵴处穿刺,抽取骨髓4～6ml,置于含有15mlα-MEM(内含10%胎牛血清,100u/ml青霉素钠,100μg/ml链霉素),和肝素的液体中混匀。分2～3部分接种于10cm培养皿,于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。倒置相差显微镜观察细胞形态及增殖情况。16～18天细胞接近80%融合时传代。台盼蓝拒染试验检测细胞活性。进行生长曲线的描记。

1.2Lipofectamine介导重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-bFGF转染。转染前一天将2×105细胞接种于覆盖有清洁载玻片的35mm2培养皿内。加入2ml含10%FBS的α-MEM培养基,37℃、5%CO2、饱和湿度培养至呈60%-80%融合时转染。按说明书制备α-MEM、Lipofectamine和质粒的混合物,室温孵育后加入细胞中混匀。

1.3转染结果的检测。

1.3.1倒置荧光显微镜观察:转基因后,在暗室中用倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX70),分别在转染后4小时、12小时、24小时、48小时、72小时,传代后24小时观察细胞中增强绿荧光蛋白(EGFP)的表达情况,采用488nm波长紫外光激发。

1.3.2转染效率的计算:沿6孔板垂直与水平经过连续视野计数EGFP阳性的细胞数,如果转染效率极低,如低于1%,则计数各孔所有EGFP表达阳性的细胞数量,共观察约20视野,按如下公式计算转染效率:转染效率=(EGFP表达阳性的细胞数/计数细胞总数)×100%。

1.3.3培养上清hBFGF-I浓度测定(bFGF ELISA kit,DSL)。取转染后各时间段的培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其中分泌的bFGF浓度。

1.3.4细胞爬片免疫组化染色:转染后48小时细胞爬片,丙酮固定后行bFGF免疫组化染色,观察是否有蛋白质水平的bFGF表达。

2.结果

2.1骨髓基质干细胞的培养:BMSCs在接种后24小时开始贴壁,逐渐伸展成长梭形,原代细胞呈集簇状分布,培养至8～10天可达到70%～90%融合(如图)。台盼蓝拒染实验测得细胞的活细胞率约为96%。按公式计算细胞群体倍增时间约为42.4小时。描记生长曲线发现骨髓基质干细胞的滞留期较短,在进入对数增长期后,在6～8天内持续分裂增殖,然后转为平台期,细胞增殖活力相对平稳,分裂渐趋稳定。在转基因后,BMSCs的分裂增殖过程变得活跃,细胞群体倍增时间缩短为38.3小时;细胞整体分裂相增多,部分细胞增大。

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2.2转基因后倒置荧光显微镜观察:将重组质粒pIRES2-EGFP-bFGF转入BMSCs后,在4小时后即可见到部分细胞表达EGFP。最初表达的绿色荧光明亮,强度高,在4小时～48小时内表达EGFP的细胞数量逐渐增多,在48小时达到高峰,其后部分先前表达的荧光强度逐渐下降。在传代后仍可见到有EGFP表达,但大多数细胞的荧光强度较第一代略有下降。经多视野阳性细胞计数计算BMSCs的转基因效率约为19±1.3%。

2.3培养上清液中hBFGF-I浓度的测定:在不同时间点取培养上清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其中有无分泌性bFGF的表达。在48小时最高可累计达到23.5ng/ml,其后浓度有所下降。这种浓度的变化趋势大致类似于荧光显微镜下观察到的EGFP变化趋势。

2.4细胞爬片免疫组化染色:转染后48小时细胞爬片行bFGF免疫组化染色,结果可见在细胞浆中有大量棕黄色深染的颗粒出现,对照组无明显着色,表明有bFGF蛋白质在细胞浆中存在。

3.讨论

在20世纪40年代就有人发现在脑与垂体中可能含有一种能促进成纤维细胞增殖的物质,之后便发现在几乎所有组织中都存在着此种物质。1974年Gospodarowicz等[1]从牛神经组织中纯化得到一种16～18kD的蛋白质并将其命名为成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)。经过多年的发展,成纤维细胞生长因子家族已经扩展到至少9名成员,即aFGF、bFGF、FGF-3/Int2、FGF-4/Hst-1/kFGF、FGF-5、FGF-6/Hst-2、FGF-7/KGF、FGF-8、FGF-9。bFGF广泛存在于脑、垂体、肝、肾、骨、软骨、角质细胞、血管平滑肌细胞、成肌细胞、星形细胞等。

bFGF是重要的有丝分裂促进分子,也是形态发生和分化的诱导因子,在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程。bFGF对中胚层及神经外胚层来源的细胞都有强烈的促有丝分裂作用,能在极低浓度水平(1ng/ml)发挥作用。对肢体发育和塑性尤为重要,对神经元的存活及突起的生长也有强的促进作用,此外还可刺激血管生长,软骨修复及骨折愈合等广泛的生物学效应。bFGF可抑制肌肉细胞的分化,呈剂量依赖效应。Julian等[2]研究发现使用1ng/mlbFGF可减少肌肉细胞分化49%,加入10ng/mlbFGF则减少80%。无bFGF时分化的肌细胞呈梭形且伴细胞突起,而bFGF存在时分化的肌细胞则呈圆形。在成肌细胞中可能存在两种亚系,FGF独立亚系在FGF存在时分化延迟,而FGF依赖亚系则需使用FGF才能获得终末分化,后者占成肌细胞的20%,在10ng/mlbFGF存在时也能进行分化。TGF-β不能刺激肌细胞分化,但与bFGF联用可阻断其抑制肌细胞分化作用。胰岛素则可强化bFGF对成肌细胞分化的阻抑效果,表明体内成肌细胞分化是多因素共同作用调节的结果。bFGF还是很强的促血管壁细胞增殖因子,对内皮细胞有趋化作用及促进有丝分裂作用,并可加速其分化,促进血管平滑肌有丝分裂,因此可能与肿瘤血管生成及转移有一定的关系。bFGF可对来源于大脑皮质、海马、小脑等的神经元有营养作用,并对胚胎神经母细胞可促进有丝分裂发生,促进神经胶质细胞增殖,因此可用于中枢及周围神经系统损伤的修复。bFGF可对多种类型的间充质细胞、成纤维细胞、角化细胞等都可促进其有丝分裂,增殖和分化,因此可能在软组织修复中有很好的应用前景。

早在1867年德国科学家便率先提出了骨髓中存在间充质干细胞的观点。现在已证实骨髓间充质干细胞在一定条件下可以分化成为多种造血外组织特别是中胚层和神经外胚层发育来源的组织细胞[3]。它们的数量非常少,在骨髓中仅占0.5%,但1个干细胞在分裂后可以分化形成红细胞20万个、粒细胞1000个,在成年机体中BMSCs约占有核细胞总数的比例可逐渐下降,但在体外培养条件下其自我增殖能力和多向分化潜能并不随年龄的增加而改变。骨髓基质细胞在体内有较强的辐射耐受性,是一个相对静止的更新率低的群体,如果用于基因治疗则遗传物质的纠正及外源基因的表达可持续相当长的时间,同时骨髓基质细胞的代谢活力很高,有利于重组蛋白的分泌,通过其旺盛的自我增殖分裂能力来提高其目的基因的转录及翻译水平。

将重组真核表达载体pIRES2-EGFP-bFGF转入BMSC后,在4小时即可见到有EGFP的表达,强度及表达数量逐渐增多,在48小时达到高峰,由于EGFP与BFGF-I在同一个启动子转录,其翻译又由于内核糖体进入位点的介入使得可以同时进行,因此在EGFP表达的同时,bFGF已经开始分泌,其强度与数量在理论上应与EGFP的表达规律相似。

bFGF基因转染对于BMSCs的分裂增殖过程也有影响,细胞群体倍增时间由42.4小时缩短为38.3小时;细胞分裂相增多,细胞形态也发生了变化。

本实验研究发现采用脂质体Lipofectamine介导也可有效地将bFGF基因转染进入体外培养的缺血性心肌病患者BMSCs,并可在一定时期内分泌相对高水平的bFGF蛋白质,并由此造成BMSCs的形态改变以及分裂增殖的加速。因此推测将基因修饰的BMSCs植入缺血的心肌组织内,有望在其中表达相对高水平的bFGF蛋白质,从而在一定时间内发挥生长因子的活性及生理作用。此外,还可同时发挥BMSCs的多向分化潜能用于修复缺血的心肌组织。因此,采用BMSCs作为心肌基因治疗的靶细胞,在将来也许可以作为积极而有效的手段。

参考文献

[1]Gospodarowicz D,Ferrarra N,Schweigerer L,et al.Structual characterization and biological factions of fibroblast growth factor. Endocr Rev,1987,8:95.

[2]Julian N,Schofield,Lewis Wolpert,et al.Effect of TGF-β1、TGF-β2and bFGF on chick cartilage and muscle cell differentiation. Exp Cell Res,1990,191:144-148.

[3]Owen M.Marrow stromal stem cells.J Cell Sci Suppl,1988,10:63-67.