双T-DNA共转化获得转基因番木瓜

摘要：番木瓜采后期间的迅速软化现象，导致果实的货架期十分短暂：利用RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体p2301／TTRG，通过农杆菌介导，探索了液体振荡转化法和浸泡转化法对番木瓜胚性愈伤组织共转化效率的影响。经抗生素敏感性测定，将卡那霉素筛选质量浓度确定为150mg·L^-1。在该质量浓度下，2种方法均获得了转基因再生植株，但转化效率仍较低。正交试验结果表明，浸泡转化法中各处理因素的作用大小为：AS质量浓度>共培养时间=菌液光密度值=侵染时间，最佳共转化组合为：100μmol·LAS+菌液光密度值0.2+侵染20min+共培养3d。经PCR和Soulhern杂交检测，所获得的5株冉生植株中有2株为共转化的结果，诱导了其中1株生根并移栽。为进一步选育无选择标记基因的抗软化转基因番木瓜奠定了基础。

关键词：番木瓜；果实软化；双T-DNA；共转化植株

中图分类号：S667.97

文献标识码：A

文章编号：1009-9980(2010)03-397-07

番木瓜(CarCA papaya L.)原产南美洲，在热带、亚热地区带地广泛种植。然而，番木瓜环斑病毒病(PRSV)的危害给番木瓜种植业带来了毁灭性的打击。美国夏威夷大学等机构的研究人员首先利用基因枪，将PRSV外壳蛋白基因转入番木瓜基因组中，培育出了全球首例的转基因果树，并进入商品化生产。随后，研究者们围绕番木瓜的转基因抗病育种，开展了以农杆菌介导为主，旨在提高番木瓜遗传转化效率的探索性工作，大大推动了番木瓜转基因研究的进程。然而，有研究表明，转基因番木瓜的种植，明显提高了其周围土壤中微生物群落对抗生素的抗性。因此，培育对环境友好，同时也是对人类健康的转基因番木瓜显得意义重大。

作为呼吸跃变型果实，番木瓜采后寿命短，不易贮藏保鲜。前人已从番木瓜果肉中分离和鉴定了ACO和ACS基因，并进行相应转反义基因的研究，拟通过调控果实内源乙烯的生物合成，延长果实的货架期。以果实细胞壁中关键的水解酶基因作为沉默的靶标。是选育生理上能够正常成熟的抗软化转基因番木瓜的另一途径。我们利用与番木瓜果实后熟软化密切相关的β-GaL基因(GenBank AccessionN0，AF064786)，构建了RNAi-β-Gal双T-DNM单质粒系统植物表达载体p2301／TTRGt。在此基础上，经由根癌农杆菌介导，转化番木瓜胚性愈伤组织，并诱导体胚发生和植株再生，获得了分子检测为阳性的转基因番木瓜。以期在高效沉默番木瓜内源目的基因的同时，获得选择标记基因与外源基因表达盒不连锁的转基因植株，为今后选育无选择标记基因的转基因番木瓜奠定基础。

1　材料和方法

1.1　材料

选用漳红番木瓜叶片和叶柄所诱导的CⅡb型胚性愈伤组织为材料。以含有植物表达载体p2301／TTRG(图1)的根癌农杆菌菌株EHA105进行侵染，进行番木瓜遗传转化体系的优化及转基因植株再生的研究。

1.2　方法

1.2.1　番木瓜胚性愈伤组织卡那霉素(Kan)敏感性测定选取长势良好的2种胚性愈伤组织，分别接种于含有不同Kan浓度(50、100、150、200、250、300mg·L^-1)的胚性愈伤组织诱导培养基[改良MS+1.0mg·L^-12，4-D+0.5mg·L^-1KT+400mg·L^-1Glu(谷氨酰胺)+30g·L^-1蔗糖]上，以接种于无Kan培养基的愈伤组织作为对照。每个Kan浓度设3个重复，每个重复接种3瓶，每瓶接种4个约0.5g的愈伤组织，分别记录接种0d、15d、30d和45d时每个重复中2种愈伤组织的质量。根据不同时期愈伤组织较0d时的质量增长率制作生长曲线，分析不同Kan浓度对愈伤组织生长的抑制作用，确定最佳的抗生素选择压。

1.2.2　农杆菌工程菌液的制备　挑取含有植物表达载体p2301／TTRG的农杆菌EHA105单菌落，至50mL含100 mg·L^-1Kan、100mg·L^-1Str(链霉素)和10μmoI·L^-1AS(乙酰丁香酮)的YEB培养基中，于28℃摇床中225 r·min-1振荡培养16 h。将菌液于3 000r·min^-1室温离心后，用等体积的MS液体培养基重悬菌体，并加入AS至相应终浓度，225r·min^-1振荡培养3h，用MS液体培养基将菌液稀释至工作浓度。

1.2.3　番木瓜胚性愈伤组织液体振荡转化法　参照Dhekney等的方法，每个重复约200gCⅡb型胚性愈伤组织。先将愈伤组织接种于含0.1g·mL^-1石英砂的MS液体培养基中，180r·min^-1，室温振荡30min，创伤外植体。之后，转接至液体体胚诱导培养基(改良MS+2.0mg·L^-12，4-D+400mg·L^-1Glu+60g·L^-1蔗糖)，接种比例约为0.2g·mL^-1液体培养基，并向其中加人农杆菌工程菌液(100μmol·L^-1AS，D^600mm=1.0)，接种量为0.06 L·L^-1液体培养基。于黑暗条件，125r·min^-1，28℃共培养3d。之后，转接至含有500mg·L^-1Carb(羧苄青霉素)的液体体胚诱导培养基中振荡培养1个月，每10d更换1次培养基。接着，转接至含300mg·L^-1Carb和150mg·L^-1Kan的固体体胚诱导培养基上继续培养至少5个月，筛选抗性愈伤并诱导体胚发生，其间每20d继代1次。体胚发生后，将单个体胚分离至含200mg·L^-1Carb和50mg·L^-1Kan的固体MS培养基上培养1～2个月诱导体胚成熟。之后，将子叶型体胚转移至含200mg·L^-1Carb的固体增殖培养基[MS+0.2mg·L^-1BA+0.02mg·L^-1NAA+20mg·L^-1ADS(硫酸腺嘌呤)+30g·L^-1蔗糖]上诱导体胚萌发以及成苗。分离体胚茎尖并转接至含100mg·L^-1Carb和50 mg·L^-1Kan的固体增殖培养基上进行壮苗培养。之后在含1／2MS+

0.5mg·L^-1IBA+1g·L^-1AC(活性炭)+30g·L^-1蔗糖的固体生根培养基上暗培养7d后，转至1／2MS+1g·L^-1AC+30 g·L^-1蔗糖的固体培养基上光照培养，进行生根诱导，待植株生根后进行炼苗和移栽。最终统计并计算体胚发生率(发生体胚外植体数／接种数)、转化率(阳性体胚数／接种数)、共转化率(共转化阳性体胚数／接种数)、污染率(污染外植体数／接种数)和死亡率(死亡外植体数／接种数)。

1.2.4　番木瓜胚性愈伤组织浸泡转化法　以AS浓度、菌液光密度值、侵染时间和共培养天数为试验因子，开展4因素3水平的L₉(3⁴)正交试验(表1)。通过侵染CⅡb型胚性愈伤组织和共培养，在选择培养基上诱导转基因番木瓜体胚发生和植株再生，优化番木瓜双T-DNA遗传转化体系，利用DPS统计软件进行正交试验统计与分析。外植体经共培养后，用无菌水冲洗6次，并在超净工作台中晾干。随后的所有步骤同“液体振荡转化法”。

1.2.5　转基因番木瓜的PCR检测　收集具Kan抗性番木瓜再生植株的叶片，以改良3×CTAB小量法提取基因组DNA。以植物表达载体p2031／TTRG上GUS基因的核苷酸序列设计一对PCR引物，检测转基因植株中是否整合了选择标记基因所处的T-DNA区段，引物序列为：GPl：5′-CTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTG-3′，GP2：5′-GGATAGTCT-GCCAGTTCAGTTCC-3′，目的片段大小为350bp；同时，在p2031／TTRG上的正义β-Gal／基因和PDK内含子之间设计一对PCR引物，以检测转基因植株中是否含有RNAi-β-Gal结构，引物序列为：CHKPl：5′-GAGAATGAGTATGGACCTATFGAGTGG-3′，CHKP2：5′-CqTCTTCGTCTTACACATCACTFGTCA-3′，目的片段大小为833 bp；最终验证转基因植株是否为双T-DNA共转化的结果。以非转基因番木瓜DNA为阴性对照，质粒p2301／TTRG作为阳性对照，分别进行2种结构的PCR检测，将2种PCR产物于同一个点样孔中进行琼脂糖电泳分析，EB染色后拍照记录。

1.2.6　转基因番木瓜的PCR-Southern杂交和Southern杂交检测

以质粒p2301／TTRG为模版。利用引物CHKPI和CHKP2进行PCR扩增，回收目的片段，利用DIG DNA Labeling and Detection Kit(Roche)，标记为探针。采用同样的引物对共转化番木瓜DNA进行PCR扩增，并以非转基因番木瓜DNA和质粒p2301／TTRG分别作为阴性和阳性对照。将PCR检测产物于1.0％的琼脂糖中，70V电压进行电泳分离，利用毛细管虹吸法将DNA转移至尼龙膜上，于80℃中2h烘干并固定DNA。杂交、洗膜以及显色的具体步骤参照试剂盒说明书，显色后拍照记录。

以质粒p2301／TrRG为模板，利用引物PDKPl：5′TGACAAGTGATGTGTAAGACGAAG-3′和PD-KP2：5′-GTTACCTTGTI"TATFCATGTFCGACT-3′，扩增长561bp的PDK内含子片段并回收，标记为探针。将共转化转基因番木瓜和非转基因番木瓜的2种基因组DNA(约10μg)和质粒p2301／TTRG，用HindⅢ于37℃酶切过夜。随后步骤同上所述。

2　结果与分析

2.1　番木瓜胚性愈伤组织的抗生素敏感性测定

与对照相比，叶片和叶柄CⅡb型胚性愈伤组织接种于含Kan的培养基后，生长速度明显下降。在Kan浓度≥100 mg·L^-1的培养基上，接种45d时，2种愈伤组织的增长量均较对照有明显的下降。随着Kan浓度的增加，愈伤组织在培养过程中的增重率呈逐步下降的趋势(图2，3)，在含300mg·L^-1Kan培养基上2种愈伤组织增长量与对照的差异均达到极显著水平。综合考虑Kan对外植体生长和体胚发生的抑制作用，将遗传转化时所使用的Kan浓度定在150 mg·L^-1。

2.2　番木瓜胚性愈伤组织液体振荡转化法

2.2.1　具Kan抗性胚性愈伤组织的体胚发生和转基因植株再生经该法所处理的胚性愈伤组织，很少出现农杆菌污染的情况。将具有Kan抗性的胚性愈伤组织继续培养2～3个月，进一步诱导体胚发生。在2次重复试验中，分别有26.18％和21.59％的愈伤组织发生体胚(表2)。经过继代培养，多数体胚逐渐白化或褐化死亡。仅发现少数生长发育较为正常的体胚(图版A)，将这些体胚转移至不含Kan的增殖培养基中诱导体胚萌发(图版B)。体胚萌发后，分离其茎尖转接至含Kan的增殖培养基中培养2个月左右，筛选具Kan抗性的再生植株，发现只有2个体胚再生植株的茎尖能够在含Kan的培养基中生长。

2.2.2　转基因番木瓜的分子检测　PCR检测结果表明，该2株转基因植株中，只有1株的基因组中同时含有GUS基因和RNAi-B-Gall结构(图4)。PCR-Southern杂交证实，共转化植株中的RNAi-B-Go／结构来自于p2301／TTRG(图5)。p2301／TTRG上包含RNAi-β-Gal结构的T-DNA区段含有2个HindⅢ位点(图1)，经HindⅢ酶切后的最小片完整地包含了PDK内含子，与探针具有同源性。杂交后，共转化植株泳道与阳性对照最小杂交片段大小相近的位置出现了明显的杂交信号(图6箭头处)，阳性对照中呈现出多条杂交带，非转基因植株的泳道中则未出现杂交信号。

2.3　番木瓜胚性愈伤组织浸泡转化法

2.3.1　不同因素对番木瓜遗传转化体系建立的效果在组织培养过程中发现，番木瓜愈伤组织普遍存在内生菌污染现象，而CⅡb型松散型愈伤的内生菌则相对较少，经农杆菌侵染后的除菌效果也较彻底。极差分析结果表明。4种因素促进CⅡb型胚性愈伤组织体胚发生的作用大小为AS浓度>共培养天数>菌液光密度值>侵染时间，适中的AS浓度(100μmol·L^-1)、延长共培养时间、较高浓度的菌液光密度值、以及缩短侵染时间都有助于提高体CⅡb型愈伤体胚发生能力。这些形成的体胚随着选择培养时间的延长，同样逐渐白化死亡，最终只有个别体胚得以存活。进一步分析不同因素间对转化效率作用的大小，结果表明。AS浓度>共培养天数=菌液光密度值：侵染时间，理论上最佳的转化法组合为：100μmol·L^-1AS+菌液光密度值0.2+侵染20min

+共培养2d。最终，通过统计共转化效率，得出各因素对提高共转化效率的作用大小一致。理论上最佳的共转化组合为：100μmol·L^-1AS+菌液光密度值0.2+侵染20min+共培养3d，即在最佳转化组合的基础上，延长共培养时间，有助于提高共转化的效率。与前种转化方法相比。该法对番木瓜胚性愈伤组织的转化效率略有提高，但仍较低。

2.3.2　转基因植株的再生与分子检测　对经浸泡转化法所获得的3个具Kan抗性的体胚转移至不含Kan的增殖培养基上，诱导体胚萌发和植株再生。收集再生植株叶片提取DNA，分别进行GUS基因和RNAi-β-Gal／结构的PCR检测。3株再生植株的基因组中，1株为双T-DNA共转化植株，1株只含外源GUS基因，1株则为假阳性转基因植株(图7)。

2.4　转基因番木瓜的生根诱导与移栽

观察发现，共转化植株在含有Kan的生根培养基中连续培养2个生长周期，仍难以生根。并有玻璃化的趋势。因此将其转接至不含Kan的生根培养基中继续培养，采用两步法诱导生根。转移至无激素的1／2MS培养基后50d左右，在茎段基部诱导出了若干条细长且具根毛的肉质根，但同时形成了一团愈伤组织(图版C)。经炼苗后，将转基因植株移栽至营养钵中(图版D)。

3　讨论

番木瓜果实采后贮藏和运输期间，以及加工过程中的快速软化与腐败变质，是制约番木瓜商品化生产的一个主要原因。我们以一条番木瓜果实后熟软化过程中的关键细胞壁水解酶基因β-Gal作为沉默的靶基因，利用RNA干扰(RNAi)技术旧取代传统的反义技术，开展番木瓜采后转基因育种的研究。目前，该技术在番木瓜抗病育种上已显示出较好的应用前景。魏军亚等利用我国番木瓜主产区环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)基因同源区段构建了RNAi植物表达载体，进行了根癌农杆菌介导的番木瓜抗病毒试验。经菌液注射番木瓜幼苗叶片，在接种PRSV病毒10～14后叶片未表现任何症状，未经注射的对照则表现出典型的花叶症状。表明，RNAi技术具有高效沉默同源目的基因的功能，是本研究继续选育性状稳定的抗软化转基因番木瓜的重要因素。

随着当今转基因技术的迅猛发展，转基因番木瓜已经实现了商品化生产，人们对转基因作物安全性问题的关注程度日渐升高，包括选择标记基因是否有毒或者会引起过敏反应，以及选择标记基因的水平和垂直转移所带来的医用安全和环境生态问题。在这样的形势下。无选择标记基因转化系统应运而生，有助于提高人民大众对转基因食品的接受程度。本研究在番木瓜上首次尝试共转化双T-DNA／单质粒系统，通过农杆菌介导转化番木瓜胚性愈伤组织，并诱导体胚发生和植株再生，初步获得了分子检测为阳性的转基因番木瓜。在转化过程中，植物表达载体p2301／TTRG上的两段T-DNA区段将发生独立转化事件，从而有望从抗性体胚再生植株中获得选择标记基因与外源基因不连锁的转基因植株。通过转基因植株的一次有性杂交便可使两者发生分离，剔除选择标记基因(nptⅡ)，选育只含外源基因(RNAi-β-Gal)的无选择标记基因转基因番木瓜，为今后选育无选择标记基因的转基因番木瓜奠定了工作基础。

然而，与单T-DNA转化相比，双T-DNA共转化进一步增加了转化的难度，同时转化植株中还存在单T-DNA转化的干扰，最终导致较低的共转化效率。相比本研究中的2种转化方式，浸泡法的效率略高于液体振荡转化法。经正交分析，该法中与外植体的转化效率和死亡率关系最为密切的因素是AS。因此，如何提高番木瓜遗传转化中农杆菌的活性，并配合最佳的外植体和遗传转化方式，以提高番木瓜的共转化效率，将是我们后续研究工作的重点。本文针对番木瓜果实货架寿命短的特点，利用RNAi技术和双T-DNA植物表达载体，优化番木瓜遗传转化体系，并获得共转化转基因番木瓜。以期后续进一步选育无抗标记的番木瓜株系，为培育对生态和人体安全的转基因食品提供借鉴。