ｎ－６脂肪酸去饱和酶ｆａｔ－１基因对神经元细胞凋亡的抑制作用

摘　要：将C.elegans n-6脂肪酸去饱和酶基因fat-1的cDNA插入到腺病毒的穿梭载体pAd-CMV中，并与骨架载体同源重组，构建腺病毒重組载体(Ad.GFP.fat1)，通过包装细胞系(293)产生重组腺病毒，感染原代培养的大鼠皮层细胞，在显微镜下观察、细胞增殖试剂盒(MTT)和凋亡染色试剂盒分析fat-1基因对大鼠皮层细胞凋亡的影响，核糖核酸酶保护性分析，检测fat-1基因在大鼠皮层细胞内的表达，酶联免疫分析花生四烯酸类(Eicosanoids)前列腺素(ProstaRlandin E₂)的含量，结果表明，通过基因重组技术，得到预期的重组病毒；fat-1基因在原代培养的大鼠皮层细胞中能有效异源表达，2d后，可检测到fat-1mRNA的条带，与对照Ad.GFP细胞相比，fat-1基因明显抑制了大鼠皮层细胞因诱导产生的凋亡(35％)，受保护细胞的前列腺素含量也明显地减少(30％)。

关键词：神经元细胞；凋亡；多不饱和脂肪酸；基因治疗

中图分类号：Q735；R741.5　文献标识码：A　文章编号：1007－7847(2007)03－0227－06

哺乳动物的大脑富含长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAS)，尤其是花生四烯酸(AA，20:4n-6)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6n-3)，许多研究已经表明DHA在大脑发育和突触形成时是不可缺少的，是神经元发挥正常功能的必需物质，人类低血压、癫痫发作、精神运动性阻滞、耳聋和视网膜病，都是与n-3 PUFA缺乏有关的几种特征性疾病。

在发育过程中，神经元细胞凋亡是常常发生的，它对神经系统的形成是至关重要的，然而，这种生理性细胞死亡的形式也与许多神经退行性疾病有关，如早老性痴呆和帕金森病，由于n-3PUFAs对正常大脑发育和功能的重要性，一些研究表明，补充DHA可促进大鼠视网膜感官器的存活，以及体外培养的神经2A和PC-12细胞的存活，而且，注射n-3脂肪酸可以防止短暂性缺血动物模型的神经元细胞死亡，还可防止癲痫发作引发的兴奋毒素性细胞死亡。

补充外源性脂肪酸是提高哺乳动物神经元n-3 PUFAs含量的唯一可能的方法，因为哺乳动物细胞既不能合成n-3 PUFAs的前体-ALA，也不能使n-6 PUFAs转变成n-3 PFAs，最近，我们发现利用C.elegans n-6脂肪酸去饱和酶(一种使n-6PUFAs转变为n-3 PUFAs的酶)的基因转移，可以增加细胞膜必需脂肪酸的组成，在本研究中，我们观察了n-6去饱和酶能否在皮质神经元中表达，以及这种酶的表达能否抑制诱导的神经元细胞的凋亡作用。

1　材料和方法

1．1　重组体腺病毒的构建

携带fat-1基因的重组体腺病毒的构建依照Kang等的方法，含有n-6脂肪酸脱氢酶cDNA(fat-1基因)的质粒经EcoR V/Kvn I切割后，插入到pAdTrack-CMV载体中，并与腺病毒骨架载体pAdEasy 1在E.coli内进行同源重组，得到2个克隆：Ad.GFP，只携带绿荧光蛋白基因(GFP，作为报告基因)，用作对照病毒，和Ad.GFP.fatl，携带2个基因fat-1和GFP，通过酶切和DNA测序检测重组载体的正确性，重组的腺病毒载体DNA用Pac I消化，回收目的大片段后与SuperFect(QIAGEN)混合，转染293细胞，包装、繁殖、分离纯化病毒后即可用于感染原代培养的大鼠皮层细胞。

1．2　组织培养和腺病毒转染

应用标准化技术制备大鼠皮质神经元，从怀孕17d的产前大鼠中分离出胚胎的皮质神经元，放置人赖氨酸包被的12孔培养板中培养，细胞浓度为每孔2×10⁶个，细胞在神经培养基(NBM，Life Technologies，Grand Island，NY，USA)中生长，并含有25mmol/L谷氨酸(美国Sigma公司)、0.5mmol/L谷氨酰胺、1％抗细菌、抗霉菌溶液和2％B27(Life Technologies)，培养条件保持在37℃，5％CO₂，相对湿度为98％，培养基每4d换一次，经过8～10d的培养，当细胞覆盖率在70％时，用Ad.GFP(对照组)或Ad.GFP.fatl感染细胞(直接把病毒颗粒加入到培养基中)，24h后换正常的培养液，48h后，进行紫外荧光显微拍照、基因表达、细胞增殖、凋亡和花生四烯酸类(前列腺素PGE₂)的定量分析。

1．3　RNA分析

使用RPAⅢ试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)通过核糖核酸酶保护性分析测定fat-1转录的mRNA，首先用总RNA分离试剂(TRIzol:Gibo公司)按说明书从培养细胞中提取总RNA，含有fat-1基因的质粒pCE8线性化后作为转录模板，在体外使用[α-³³p]UTP、T7多聚酶(Riboprobe System，T7 kit，Promega，Madison，WI，USA)转录反义RNA，与从神经元中提取出来的总RNA进行杂交，用核糖核酸酶消化以去除非杂交RNA和探针，被保护的杂交双链RNA：RNA在5％变性凝胶中电泳分离，干胶后放射自显影，β-actin的探针用作内参照。

1．4 凋亡的诱导以及细胞生长的检测

通过撤除生长因子诱导凋亡，转染48h后，培养基换成神经基质培养基，含有25μmol/L的谷氨酸(Sigma)，0.5μmol/L谷氨酰胺，生长因子撤除24h后，应用Vybrant^MT凋亡分析试剂(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)检测细胞的凋亡，简言之，用冰冷的PBS洗涤细胞，接着把细胞放于含有Hoechst 33342(1mL/L)和propidimiodide(PI)(1mL/L)的冰冷PBS中20～30min，然后显微拍照和凋亡百分数的统计，即在同一视野下，查出感染细胞数和凋亡细胞数，后者与前者之比即是凋亡百分数。

细胞生长或生存力的检测采用MTF细胞增殖试剂盒(Roche Diagnostic Corporation)，在每个孔中加入MTY试剂100μL，保温4h后，在每孔中加入1mL溶解液，然后37℃过夜，用分光光度仪在600nm波长测定吸光度。

1．5　花生四烯酸类物质(前列腺素E2)的测定

前列腺素E，的测定采用酶联免疫分析试剂盒(Assay Designs，Ann Arbor，MI，USA)(与前列腺素E₃的交叉反应几率为16％)，用磷酸盐缓冲液(PBS)(1％牛血清)洗涤培养的细胞，然后放置于

含钙离子载体(5μmol/L)的PBS缓冲液中保温，10min后条件[生缓冲液陕复，用于二十烷类的测定。

1．6　数据分析

细胞生存力(MTT)和二十烷类(前列腺素E₂)水平的数据比较采用Student"s t-test，所有分析都是每组6孔细胞，并且每一部分实验重复3次，显著性界限值为p＜0.05。

2　结果

2．1　携带fat-1基因的重组腺病毒载体的构建质粒fat-1cDNA经EcoR V/Kpn I切割后，插入到pAdTrack-CMV载体中，并与腺病毒骨架载体pAdEasy 1进行同源重组，得到重组的腺病毒Ad.GFP.fat1，携带2个基因fat-1和GFP(图1所示为其图谱)，另外还得到克隆Ad.GFP(只携带绿荧光蛋白基因GFP，作为报告基因)，用作对照病毒，重组腺病毒载体DNA用Pac I和BamH I消化，序列测定进行鉴定，结果都表明该重组载体的结构是正确的(图2)。

2．2　大鼠皮质神经元中fat-1基因的表达

转染Ad.GFP.fatl后表达fat-1基因的大鼠皮质神经元细胞，在同时表达GFP后很容易在荧光显微镜下辨别出来(它表现为亮的绿色荧光)，转染48h后，30％～40％的神经元转染成功，并表达GFP基因(图4，a，A)，fat-1基因的表达情况使用核酸酶保护性分析(ribonuclease protection assay)mRNA显示，fat-1 mRNA在Ad，GFP.fat.1感染的细胞中含量丰富，但在Ad.GFP(对照)感染的细胞中却检测不到fat-1mRNA(图3)，因为大鼠皮质神经元细胞在正常情况下是缺乏该基因的，但对于内参照基因β-actin，两组细胞都有同样高水平的表达，这个结果说明，在正常情况下缺乏fat-1基因的大鼠皮质神经元细胞中，腺病毒介导转移的fat-1基因可以出现非常高的表达。

2．3　fat-1对大鼠皮质神经元细胞凋亡的抑制

我们对基因转移后的细胞增殖和凋亡进行分析，以确定fat-1表达对神经元细胞生长的影响，凋亡的诱导是通过24h的生长因子的撤除，凋亡诱导24h后，用Hoeehst 33342(1mL/L)和PI对皮质培养细胞进行染色，结果表明Ad.GFP.fat-1转染的细胞凋亡数量明显少于Ad.GFP转染的细胞图4E(b，B)和F(相对于对照，下降了32％)，这说明fat-1基因的表达可以有效地保护大鼠的皮质神经元免于凋亡。

2．4　MTT分析

为了确定fat-1基因的表达对细胞增殖的影响，在Ad.GFP.fat1感染2d后，用细胞增殖试剂盒测量(MTT，Roche Diagnostics Corporation)分析，诱导神经元细胞凋亡后的MTT分析显示，表达fat-1基因的细胞溶液，与对照(只表达GFP基因)相比，其600nm下的吸收值高出25％，即Ad.GFP.fat1转染的细胞生存力明显高于Ad.GFP转染的细胞，统计分析显示具有显著差异(P＜0.05)(图5)，Ad.GFP转染的细胞和非转染细胞对凋亡的反应没有差别，这些结果表明，fat-1的表达能够抑制神经元细胞凋亡，提高细胞生存力。

2．5　对花生四烯酸类物质(前列腺素E₂)的影响

如前所述，在与衰老相关性的神经退行性疾病和急性兴奋毒素损伤如缺血中，两个系列的二十烷类与神经元细胞凋亡有关，花生四烯酸(AA，20:4n-6)和二十碳五烯酸(EPA，20:5n-3)分别是n-6和n-3系列二十烷类的前体，为了检测基因转移介导的AA和EPA含量的变化是否可以导致细胞中二十烷类产物的不同，我们先用钙离子载体calcium ionophore A23187刺激转染细胞，然后采用酶联免疫试剂盒测定转染细胞中前列腺素E₂的含量，它是衍生自AA的主要的二十烷类，结果如图6所示，表达fat-1的细胞中前列腺素E₂的含量比对照组细胞下降了25％±3.3％，这说明fat-1基因降低了花生四烯酸类物质的含量。

3　讨论

本研究发现编码n-6去饱和酶的C.elegensfat-1基因的表达可在大鼠皮质神经元细胞有效表达，并降低细胞内二十烷类物质(前列腺素E₂)的含量，从而保护大鼠皮质神经元免于凋亡，并增加其细胞生存力，这些结果表明基因转移在对抗神经元细胞凋亡的保护作用，酷似补充n-3脂肪酸的保护效应，并且阐明了降低细胞内二十烷类物质(前列腺素E₂)的含量在保护神经元方面的重要性。

对动物模型和人类新生儿的研究显示，n-3脂肪酸缺乏可以导致视网膜和大脑的异常发育，尤其是早产儿，n-3 PUFA缺乏的动物模型会出现记忆力、空间性和皮层依赖性听力的缺陷，以及视力的丧失，还有研究显示人类许多神经性疾病状态与n-3 PUFA缺乏有关，值得重视的是，最近的调查显示我们现在饮食中的n-6PUFAs过量，而n-3 PUFAs相对缺乏，造成组织中n-6 PUFAs过量、n-3 PUFAs缺乏，这可能就是包括神经退化、癌症在内的现代病增加的原因之一，因此，找到一个合适的方法降低n-6PUFAs、增加n-3 PUFAs，对防治神经性退化一类的病症是非常必要的，目前，唯一的方法就是向饮食中添加n-3 PUFAs，因为他们不能被人体所合成，而必须从饮食中获得，然而，饮食的方法却有若干局限性，而能迅速转化过量的内源性n-6 PUFAs成为对应的n-3 PUFAs的方法是最理想的。

基因转移技术的应用使得有可能调节人类细胞的脂肪酸组成而不需提供外源的n-3 PUFAs，我们目前的结果说明，腺病毒介导的n-6脂肪酸去饱和酶在大鼠皮质神经元细胞内的表达，可以作为这一理想的方法，在不补充外源性n-3PUFAs的情况下，对大鼠皮质神经元具有保护作用，可对抗生长因子撤除诱导的凋亡，进而起到抗神经性退化的效果。

有研究已经表明，在衰老相关性神经退行性疾病中和急性兴奋毒紊性损伤如缺血时，前列腺素与神经元细胞凋亡有关，在转染Ad.GFP.fat-1 48h后，我们测定了前列腺素E₂的生成量，它是AA(n-6 PUFA)的主要衍生物，结果显示，与仅转染GFP的对照组细胞相比，转染fat-1的细胞中前列腺素E，的生成量显著下降，因此，fat-1表达的神经保护陸作用部分是由于前列腺素的产生和分泌下降，这又减少了对整个细胞群的损伤作用。

前列腺素E₂生成量的下降可能是由于磷脂酶A2(PLA₂)的底物减少(n-6向n-3 PUFA转变的结果)，或是由于n-3 PUFA对PLA₂活性的直接抑制，或是二者兼而有之，有研究已经表明DHA(大脑n-3 PUFA存储的主要形式)能够影响AA的释放，是前列腺素生物合成的有效的抑制剂，Shikano等也指出在体外有DHA存在时，PLA₂对AA的水解明显减少，而且，H.Y.Kim等报道补充DHA能减少caspas-3的激活和表达，而它可以粘附和激活PLA₂诱导凋亡。

总之，病毒介导的n-3脂肪酸去饱和酶的基因fat-1转移能够抑制由生长因子撤除所诱导的神经元细胞的凋亡；不需要补充外源性n-3 PUFAs即可快速有效地降低二十烷类物质，并因此对神经元细胞发挥抗凋亡效应，与膳食干预相比，这种方法在平衡n-6:n-3脂肪酸方面更有效，因为它能自发地降低内源性n-6PUFAs的水平，提高组织中n-3PUFA。的浓度，因此，本研究首次开辟了一种新颖有效的修饰哺乳动物神经元细胞脂肪酸的方法，并且为基因治疗作为中风病人的一种辅助治疗或化学干预手段提供了潜在的应用基础。

作者简介：张金玉(1968－)，女，山东日照人，青岛大学医学院副教授，硕士，主要从事分子生物学方面的研究。葛银林(1957－)，男，河南新蔡人，青岛大学医学院教授、博士生导师，博士，通讯作者，主要从事基因治疗研究。