罗氏沼虾野田村病毒3种检测方法比较

摘要：胶体金免疫层析技术、RT-PCR、RT-LAMP 采用的抗体和特异性引物均针对罗氏沼虾野田村病毒的衣壳蛋白和编码基因RNA2。采用这3种方法分别检测罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV），结果表明，免疫胶体金检测试纸能快速检测感染罗氏沼虾野田村病毒的幼虾，但灵敏度较低，能用来检测具有疑似病症的样品；RT-PCR和RT-LAMP检测灵敏度都优于免疫胶体金检测试纸，但RT-PCR方法操作步骤繁琐，所耗时间较长，而RT-LAMP方法操作简便、用时短、不需要特殊仪器，在产物中加入核酸染料后检测结果可用肉眼直接判定。因此，RT-LAMP方法更适合基层和现场检测，其相关试剂盒的研发更具有应用前景。

关键词：罗氏沼虾野田村病毒；免疫胶体金技术；RT-PCR；RT-LAMP；检测

中图分类号： S945.4+19文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0214-03

收稿日期：2013-12-19

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201103034）；浙江省湖州市科技项目（编号：2012GN08、2011ZD2005）；浙江省淡水养殖科技创新团队建设（编号：2012R10026-11）。

作者简介：林锋（1980—），男，硕士，助理研究员，主要从事水产病原微生物研究。E-mail：wwlinfeng@163.com。

通信作者：刘莉，副研究员，从事水产动物病害防治研究。E-mail：liuli6655@hotmail.com。罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）是一种生长快、病害较少、易养殖的淡水养殖虾，目前已经成为我国淡水养殖的主要品种之一，江浙一带是主要产地。罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV）是危害罗氏沼虾淡化苗的主要病毒，会导致病虾肌肉出现白斑、白浊或全身发白，通常被称为罗氏沼虾白尾病（white tail disease，WTD），严重时死亡率高达90%以上[1]，对罗氏沼虾养殖业造成极大的危害，已被列为OIE申报疫病和我国水生动物二类疫病。2011年至今，广东、浙江、江苏、上海等地连续几年在罗氏沼虾幼苗抽检中均检测到该病毒，对该病毒的防控工作还有待加强。目前，罗氏沼虾野田村病毒的检测方法有电镜法、病毒核酸鉴定法、RT-PCR检测法、TAS-ELISA检测法等[2-6]，其中，RT-PCR是现今最为常用、也是最为经典的检测方法。环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplication，LAMP）是近年发展起来的一种新颖的核酸扩增技术，在恒温条件下高效扩增核酸，具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点[7]，已被广泛用于人、动植物病毒和细菌检测。本试验在前人研究基础上，结合实际应用需要，采用胶体金免疫层析技术、RT-PCR、RT-LAMP 3种方法分别检测人工感染MrNV的罗氏沼虾幼苗和成虾，对3种检测方法的优劣进行比较和分析，以期为罗氏沼虾病毒病的实际诊断提供必要的技术支持。

1材料与方法

1.1材料

MrNV病样由浙江省淡水水产研究所实验室人工攻毒制备，MrNV单克隆和多克隆抗体自行制备[8]；RNA提取试剂盒（viral RNA mini kit）购自Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、M-MLV 逆转录试剂盒、DL2000 Marker、100 bp DNA Ladder Marker购自TaKaRa公司；Bst DNA 聚合酶大片段购自New England BIPolabs公司；AMV酶、dNTP购自Promega公司；甜菜碱、硫酸镁等购自Sigma公司。

1.2引物和探针的设计与合成

RT-PCR引物采用世界动物卫生组织（OIE）推荐的MrNV特异性引物[9]；RT-LAMP反应所用引物和探针根据GenBank公布的MrNV编码衣壳蛋白基因RNA2序列，由在线软件PrimerExplorer V4（http：//primerexplorer.jp/e/）设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，从中选出特异性和灵敏度较佳的2对引物，其中包括2条外引物（F3、B3）和2条内引物（FIP、BIP）（表1）。引物由上海生工生物公司合成。

1.3MrNV胶体金诊断方法的建立

1.3.1MrNV胶体金检测试纸的制备在实验室自行制备鼠抗MrNV单抗和兔抗MrNV多抗的基础上，与杭州某生物公司合作，以兔抗MrNV的多抗作为第一抗体吸附在结合垫上，再用鼠抗MrNV单抗与胶体金颗粒标记，制成MrNV病毒测定胶体金试纸条（图1）。

1.3.2MrNV胶体金检测试纸的应用称取50 mg罗氏沼虾幼苗或成虾肌肉组织置于离心管中，加入200 μL PBS缓冲液，研磨匀浆，5 000 r/min离心2 min；用吸管吸取上清液，滴1～3滴到图1所示样品S孔中，等待2～5 min观察结果。如分别在C（质控线）和T（检测线）处出现沉淀线，表明样品为MrNV阳性；如仅有C线出现沉淀线，表明样品为MrNV阴性；如没有条带出现，表明该胶体金检测试纸条为不合格品。

1.4RT-PCR和RT-LAMP反应

1.4.1病毒RNA的提取称取病毒样本50～100 mg，用Qiagen公司的RNA提取试剂盒（viral RNA mini kit）提取样本病毒RNA，操作步骤参照说明书进行，提取单个样品RNA约10 min。提取的总RNA溶于50 μL双蒸水中，利用超微量分光光度计（NanoDrop2000，USA）对核酸浓度进行定量分析。-80 ℃保存备用。

1.4.2RT-PCR反应体系取4 μL RNA模板，利用 M-MLV 逆转录试剂盒得到cDNA，进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min，30个循环后72 ℃ 15 min；1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。

1.4.3RT-LAMP反应体系1.6 mmol/L MrNV-FIP和MrNV-BIP、0.2 mmol/L MrNV-F3和MrNV-B3、0.05 μmol/L MrNV-PROBE、20 mmol/L Tris-HCl （pH值80）、10 mmol/L氯化钾、15 mmol/L硫酸铵、8 mmol/L硫酸镁、0.1% Triton X-100、0.6 mol/L甜菜碱、1.4 mmol/L dNTP、1 U 逆转录酶AMV、8 U Bst DNA 聚合酶大片段，终体积为25 μL；模板4 μL。反应条件为：63 ℃反应45 min，85 ℃保温5 min终止反应。反应前，将封存于反应管盖的核酸染料快速振荡，与反应产物混合均匀，静置5 min后，通过颜色变化判定结果。

2结果与分析

2.1MrNV胶体金检测试纸条的制备与应用

将阳性虾组织匀浆液上清进行10-1～10-8梯度稀释，利用MrNV胶体金检测试纸条进行检测，结果表明，胶体金检测试纸条仅能检测到10-2倍稀释度时的样品（图2）。整个检测过程在10 min内可以完成。

2.2MrNV RT-PCR检测

将提取的MrNV RNA进行10-1～10-8梯度稀释，经过RT-PCR反应，琼脂糖凝胶电泳，结果显示，对于稀释度大于10-5的样品无法检出（图3）。整个检测过程大概需4～5 h。

2.3MrNV RT-LAMP检测

以10-1～10-8逐步梯度稀释MrNV RNA为模板，进行环介导等温扩增，产物同时用琼脂糖凝胶电泳和核酸染料染色，结果表明，凝胶电泳1～5号泳道能清楚观察到阶梯状条带，泳道6和泳道7能勉强看到条带（图4）；核酸染料染色法检测，1～5号管为绿色，7和8号管为橙红色，而6号管处于2种颜色的过渡阶段，其中，绿色为阳性，橙红色为阴性（图5）。

3讨论

罗氏沼虾野田村病毒是引起罗氏沼虾幼体产生白体病的病原， 发病高峰期死亡率高达100%。自2004年该病毒从罗氏沼虾白体病样品中被分离出来，其检测方法不断更新发展，

从电镜观察发展到分子生物学方法检测，使得罗氏沼虾白体病得到有效控制。但是，近年来，通过在广东、广西、浙江、江苏、上海等地苗场和养殖场抽样调查和采集病样，发现MrNV有死灰复燃迹象，加强该病的检测与预防显得十分重要。

本试验在实验室原有研究的基础上，选取了目前比较流行的3种病原检测方法对MrNV进行检测比较分析。胶体金检测技术已经被广泛用于医学、动植物病原和食品安全监督等各领域[10]，环介导等温扩增技术自2000年开发以来，已被用于细菌、病毒、寄生虫和胚胎性别鉴定等检测[11-18]。从试验结果可以看出，胶体金试纸条检测法速度快捷、操作方便，但灵敏度相对于PCR方法较低；RT-PCR检测法作为比较经典的检测方法，灵敏度远高于胶体金检测法，但整个操作过程耗时比较长，比较繁琐；RT-LAMP检测法相对于胶体金检测法而言，整个过程要长一些，全程大约要45～60 min，但灵敏度上有显著优势，是RT-PCR的100倍左右。3种方法相比较，各有优缺点。

在实际检测过程中，可以根据需要作适当选择，比如，针对已具有肌肉白浊特征的虾样，完全可以用胶体金检测法进行病原诊断；对一些抽检样品，时间和空间上允许的话，可以采用RT-PCR法；从操作简便、快捷且灵敏度高的角度出发，RT-LAMP 是三者中最好的选择，特别是近年来RT-LAMP反应产物检测方法的不断发展，由最初的比浊法到现在的比色法，减少了琼脂糖电泳的过程，而且检测结果的灵敏度也近似，这大大节约了时间，降低了成本。因此，相对而言，RT-LAMP方法在水生病原检测工作中更具有应用前景，特别是反应产物检测方法的发展，LAMP技术得到进一步完善，更有利于相关检测试剂盒的开发和应用。

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