副溶血性弧菌检测新方法研究进展

摘 要：副溶血性弧菌广泛存在于水产品中，人们常因食用了被其污染的食物而引起食物中毒，導致胃肠疾病，是食源性疾病暴发的重要病原之一。目前检测该菌的方法较多，本文就近年来出现的检测新方法进行了综述，以期为相关研究提供参考。

关键词：副溶血性弧菌;环介导等温扩增技术;核酸适配体;噬菌体

Abstract：Vibrio parahaemolyticus （VP）is a food-borne pathogen that is widely found in seafood. Consumption of V.p contaminated aquatic products can cause gastroenteritis and lead to disease outbreaks. There are many methods for detecting it. This paper reviews the new detection methods in order to provide references for relative research.

Key words：Vibrio parahaemolyticus; LAMP; Aptamer; Bacteriophage

中图分类号：R515.9

副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，VP）是沿海沿江地区常见的一种革兰氏阴性嗜盐菌，其能通过感染多种水产品而导致人和动物的食物中毒，是目前我国海产品中受污染程度最严重的病原菌之一[1-2]。近年来，副溶血性弧菌导致的食源性疾病发生比率呈现逐年上升的趋势，人们对其越来越关注。而预防其爆发的关键是快速、高效、便捷、灵敏又经济的检测手段[3]。

副溶血性弧菌的传统检测方法是采用细菌分离、培养并鉴定的方法，如现行国家标准GB 4789.7-2013等。该检测方法准确且费用低，但检测工作量大、周期长，因而常常错过最佳控制时期。随着科技的快速发展，其检测方法也越来越多样化[4]，如基于分子生物学的多种检测法、基于免疫学的检测法和基于电化学的检测法等。本文主要就近年来出现的几种适用于VP的新型检测方法进行总结，以期为相关研究提供参考。

1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等人于2000年发明的一种新的核酸扩增技术，它是根据目标基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温（60～65 ℃）条件下维持30～40 min完成低水平基因迅速扩增到可检测水平，在目标DNA大量合成的同时伴随有焦磷酸镁沉淀的产生，可以直接通过肉眼观察浊度的变化或加入荧光染料观察颜色的变化来判定反应结果。

LAMP技术主要包括哑铃状模板合成、循环扩增、伸长和再循环4个阶段。近年来，LAMP在VP的快速检测的研究中应用较多，在选择检测目标基因时，需要充分考虑菌株的毒素编码基因[5-6]，如副溶血弧菌的不耐热溶血素（tlh）、耐热溶血素（tdh）、相对耐热直接溶血素（trh）、卵磷脂依赖溶血素（ldh）和毒力表达调控基因（toxR）。

近年来，LAMP技术被广泛应用于食品中致病菌的检测，其中包括对VP的检测。Yamazaki[5]等人以VP的tdh和trh基因为靶标设计引物tdh、trh1和trh2，并对130株不同弧菌种菌株进行检测，其灵敏度分别为0.8、21.3和5.0 CFU·mL-1。Chen[6]等人以VPtoxR基因为目的基因设计引物对其纯培养物的最低检测线可达47～470 CFU/25 μL;对受污染牡蛎的最低检测线达1.1×105 CFU·g-1。

随着LAMP技术的发展，LAMP结合其他技术建立起来的检测技术也取得了新的突破。如Prompamorn[7]等人结合横向流动纸条（lateral flow dipstick，LFD）建立了一种LAMP-LFD技术，对87株致病菌检测的特异性达到了100%，对虾肉样品中VP的最低检测线达到1.8×103 CFU·g-1。Zeng[8]等人将LAMP与免疫磁珠相结合建立了IMS-LAMP技术，对133株菌株检测的特异性同样达到了100%，对受VP污染的牡蛎样品的最低检出限为1.9×103 CFU·g-1。

结果表明，LAMP技术的高特异性和高灵敏度，且操作简便、检测成本低、具有广泛的应用前景，但该技术中引物设计负载、扩增难以定量等问题仍需要进一步研究。

2 核酸适配体检测

核酸适配体（Aptamer）是一段脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）序列，核酸类似物（XNA）或肽，通常是利用指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential eichment，SELEX），从核酸分子文库中筛选得到的一段可与T4 DNA聚合酶特异性结合的随机寡核苷酸片段。迄今为止，已筛选出200多种靶物质的核酸适配体，同时也发明出多种筛选技术。其中，用于食源性致病菌适配体的筛选技术主要有全细胞-SELEX技术、磁珠-SELEX技术、亲和层析-SELEX技术和Non-SELEX技术等，适配体的结合方式又包括纳米金适配体技术、荧光适配体技术、电化学适配体技术、流式细胞适配体技术、表面增强拉曼散射适配体技术[9]。

Duan等[10]于2012年采用流式细胞适配体技术对羧基荧光素（FAM）标记的副溶血弧菌进行全细胞-SELEX筛选，获得了可直接应用于检测VP的最佳适配体，并建立了能同时检测VP与鼠伤寒沙门氏菌的流式细胞适配体技术，该技术对两种细菌的最低检测限均为5×103 CFU·mL-1，也可在虾样品中的VP进行特异性定量检测[10]。核酸适配体具有检测速度快、特异性强、灵敏度高，稳定性好、易于修饰等特点，且可与荧光、流式细胞仪、电化学、纳米金、表面增强拉曼等技术相结合以进一步提高其灵敏度并缩短检测时间，但仍有一些技术瓶颈需要解决才能满足现场快检的要求，如适配体筛选效率低、检测仪器庞大、价格昂贵等。分析全面等技术优点。

3 基于噬菌体的检测法

噬菌体是一类以活细菌、活真菌或藻类等微生物为寄主的病毒的总称，有严格的宿主特异性，具有病毒的一般特性，广泛存在于自然界。由于噬菌體结构简单、高度特异性、易于获得并批量生产、能区分活死细菌且易于与结合其他检测方法等优点，因此，基于噬菌体的快速检测细菌的方法迅速发展起来，如与分子生物学、免疫学和纳米科学等结合开发了多种操作简单、高灵敏、短耗时的检测方法[11]。

报告噬菌体法是目前常用的检测方法。通过基因工程法改造噬菌体，使其含有能够编码荧光发色的基因或其他可表达的被标记物基因，当宿主菌被噬菌体特异性识别后，噬菌体通过侵染细胞将其DNA注入宿主细胞内，随后报告基因在宿主菌体内大量表达，便可快速检测到宿主菌。常见的报告基因有：绿色荧光蛋白基因（gfp）、荧光素酶基因（lux和luc）、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、冰核蛋白基因（inaW）、碱性磷酸酶等。

噬菌体与发光试剂联用也是目前噬菌体检测的研究热点。如利用噬菌体裂解宿主菌释放细胞内物质ATP，ATP在荧光素酶的作用下发光，根据其荧光强度与ATP的含量对比来推测宿主菌浓度[11]。噬菌体除了可以与生物发光试剂联用外还可与化学发光试剂和物理发光联用。

噬菌体可与传感器联用，并通过将其产生光信号、电化学信号、热信号等生物信号转换成可测量的数码读数，根据读数的变化来检测致病菌。目前已在大肠杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等致病菌的检测中得到应用[12]。此外，噬菌体还可通过与液相、质谱联用来对样品中的致病菌进行定量测定[13]。

目前，基于噬菌体检测的方法已趋于成熟，国外已开发出一些商用检测试剂，如，法国梅里埃生物公司的Vidas®up重组噬菌体，已取得ISO和AOAC权威认证;美国Sample6公司结合噬菌体与荧光素酶研制出的沙门氏菌检测系统[14];检测美国Micro Phage公司的金黄色葡萄球菌噬菌体扩增检测技术。

虽然噬菌体检测法的推广还存在了一些阻碍，且在VP检测中的相关报道还不多见，但由于噬菌体检测具有独特的优势，且随着对VP噬菌体研究及其与基因工程、基因组测序、纳米等技术的深入联合，其商业化检测进程将会得到快速的发展。

参考文献：

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