BMI1对依托泊苷抑制乳腺癌细胞MCF7增殖的影响

[摘要] 目的 观察BMI1对依托泊苷（ETOP）抑制体外培养的乳腺癌细胞增殖的影响及机制。 方法 选择对数生长的乳腺癌细胞MCF7，分为空白对照组、实验组（加ETOP）。采用MTT法检测细胞活性，流式细胞术（FCM）测定各组MCF7肿瘤细胞凋亡率及细胞周期变化；应用免疫组化检测MCF7 BMI1蛋白和ATM蛋白表达的变化。 结果 与对照组相比，实验组对乳腺癌细胞的增殖具有明显的抑制作用（P<0.01）。细胞周期分析显示，实验组使乳腺癌细胞的S期细胞比例减小（P=0.018），G1期细胞比例增大（P=0.021）。ETOP能够降低BMI1蛋白表达（P=0.008），增加ATM蛋白的表达（P<0.01）。 结论 ETOP能明显抑制乳腺癌细胞的增殖，其机制可能与细胞周期发生停滞及其下调BMI1蛋白和增加ATM蛋白的表达而诱导细胞凋亡有关。

[关键词] BMI1；依托泊苷；ATM；乳腺癌

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）27-0032-04

[Abstract] Objective To observe the effect of BMI1 on Etoposide inhibiting proliferation of breast cancer cell MCF7 and its mechanism. Methods The breast cancer cells MCF7 grown in logarithm were selected and divided into blank control group and experimental group（added with ETOP）. The cell viability was detected by MTT assay. The apoptosis rate and cell cycle of MCF7 tumor cells were detected by flow cytometry（FCM）. The expression of MCF7 BMI1 protein and ATM protein were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the control group， the experimental group had a significant inhibitory effect on the proliferation of breast cancer cells（P<0.01）. Cell cycle analysis showed that the proportion of S phase cells in breast cancer cells of the experimental group was decreased（P=0.018） and the proportion of cells in G1 phase increased（P=0.021）. ETOP decreased BMI1 protein expression（P=0.008）and increased ATM protein expression（P<0.01）. Conclusion ETOP can significantly inhibit the proliferation of breast cancer cells， which may be related to the arrest of cell cycle， down-regulate BMI1 protein and increase the expression of ATM protein to induce apoptosis.

[Key words] BMI1；Etoposide；ATM；Breast cancer

乳腺癌是女性最常見的侵袭性肿瘤，发病率呈逐渐递增趋势。深入探讨细胞信号通路分子对乳腺癌发生过程中的调控作用，寻找有效的分子作用靶点，将为肿瘤的抗癌药物研发和临床治疗提供有益的思路。多梳蛋白在维持造血干细胞和神经干细胞自我更新潜能方面具有重要作用，某种程度上是由于它能抑制细胞增殖抑制剂方面的表达，包括p16INK4A，p19ARF/p14ARF和E4F13-61-3。INK4A和ARF是重要的肿瘤抑制因子，基于与c-myc的合作被单独作为一个致癌基因。原癌基因B细胞特异性小鼠白血病病毒插入位点1（B-cell-specific Moloney mufine leuke-mia virus insertion site 1，BMI1）基因是一种重要的细胞原癌基因。BMI1的升高最初是在淋巴瘤中发现的，而且是于预后不良的患者淋巴瘤中发现的，BMI1的过度表达改变了淋巴细胞[4]。BMI1也促进肿瘤的发生，包括多种恶性肿瘤，如非小细胞肺癌[5]、结肠癌[6]、乳腺癌[7]，鼻咽癌[8]。本研究旨在探讨抗肿瘤药物依托泊苷对体外培养的乳腺癌细胞增殖的影响及机制，及其发生DNA损伤时所引起的相关蛋白表达的变化情况，为依托泊苷作用乳腺癌MCF7细胞DNA损伤反应的研究提供相关的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养

人类乳腺癌细胞株MCF7由中国科学院上海生物科学研究所提供，培养基为RPMll640（产自GIBCO公司），含10%灭活胎牛血清和100 U/mL青霉素，培养箱参数设置为37℃、5%CO2浓度。

1.2 主要试剂和仪器

依托泊苷、环磷酰胺均产自于Sigma公司，ATM蛋白、BMI1蛋白免疫组化试剂盒，DAB显色试剂（由武汉博士德有限公司提供）；流式细胞仪、HIMAS-1000病理图文分析系统（FACScan，Beckman公司）。

1.3 MTT法检测细胞增殖

取处于对数生长期的MCF7细胞，以100 μL/孔，细胞浓度1×105个/mL，以加入96孔细胞培养板，培养细胞至贴壁后，环磷酰胺组每孔加入100 mg/L环磷酰胺药液200 μL；实验组每孔加入100 mg/L依托泊苷药液200 μL，对照组每孔加入等体积的培养基。在饱和湿度、37℃、5%CO2浓度培养条件下，分别培养24、48、72 h。在终止培养前4 h，每孔加入10 μL MTT染液（10 mg/mL），正常条件继续培养4 h后，每孔加入100 μL SDS药液（100 g/L）终止培养，37℃放置过夜，酶标仪检测波长为570 nm条件下的OD值，计算细胞生长抑制率（IR）[9]。抑制率（%）=（OD值对照组-OD值实验组）/OD值对照组×100%。

1.4 流式细胞术检测依托泊苷对MCF7细胞周期和细胞凋亡的影响

取-20℃预冷的70%乙醇固定的细胞样品，用预冷的PBS洗涤两次，加PI染液，4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡比率和细胞周期变化。

1.5 免疫组化法检测BMI1和ATM蛋白表达变化

取对数生长期的实验组和对照组细胞，以细胞浓度1×105个/mL涂片，以H2O2药液（3%）室温封闭10 min，PBS洗涤，枸橼酸缓冲液（0.01 mol/L）浸泡，高温高压后缓慢冷却至室温。具体实验操作按照“链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法”进行。BMI1和ATM单克隆抗体1：100稀释，阴性对照以PBS液替代Ⅰ抗。图像分析用Image-ProPlus軟件进行分析，每组实验涂片随机取10个视野检测细胞BMI1和ATM 蛋白表达阳性的吸光度积分，平均值表示BMI1和ATM 蛋白表达强度，蛋白阳性产物表达越强则吸光度值越大。

1.6 统计学方法

用SPSS18.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞细胞周期和凋亡指数比较

细胞增殖抑制与对照组细胞抑制率（0）相比，依托泊苷实验组（65.8%）、环磷酰胺组（53.9%）对乳腺癌MCF7细胞具有显著的增殖抑制作用（P<0.01）。细胞周期变化与对照组相比，实验组S期的细胞比例显著降低（P=0.025），G0/G1期的细胞比例显著升高（P=0.0007）。见表1、图1。

2.3 细胞BMI1和ATM蛋白表达情况比较

与对照组比较，依托泊苷显著降低BMI1蛋白表达量（P=0.016），显著增加ATM蛋白表达量（P<0.01）。见表2、图2。

3 讨论

细胞凋亡与增殖的失衡以及细胞周期紊乱是肿瘤发生的两个重要机制。一方面通过诱导和促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞增殖；另一方面可以调控肿瘤细胞的增殖周期，使肿瘤细胞不能进行正常的细胞分裂，通过研究细胞凋亡和细胞周期获得治疗肿瘤的策略和方法。抗肿瘤药物依托泊苷（Etoposide Injection，ETOP）具有快速、高效和低毒副作用的特点，已广泛应用于多种实体肿瘤的治疗。BMI-1 基因位于染色体10 p12.2，其mRNA 约为3199 bp，有 10 个外显子，其序列在人和小鼠之间具有高度同源性[10]。BMI1基因是一种重要的细胞原癌基因，目前还不完全了解BMI1在维持干细胞和促进肿瘤发生的详细机制，BMI1对表观遗传介导的基因表达的影响被广泛认为是有助于这些过程。BMI1是多梳抑制复合物，其含有E3泛素连接酶，其介导组蛋白H2A在赖氨酸119的泛素化，从而导致多梳复合物1介导的基因沉默。E3连接酶的形成是在BMI1结合到催化亚基RING2时，这种E3泛素连接酶的活性有助于BMI1在干细胞生物和肿瘤中的功能[11-12]。最近证明BMI1在干细胞和肿瘤发生中的作用是在DNA损伤反应（DDR）发生作用。共济失调-毛细血管扩张突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）是与DNA损伤修复密切相关的肿瘤抑制基因[13]。肿瘤通常灭活或减弱检查点蛋白，包括ATM、CHK1、NBS1和P53。检查点激活是DDR的一个重要方面，DNA损伤最致命的形式是双链DNA断裂（DSB），DSB激活ATM，会导致下游目标蛋白的磷酸化和激活，包括γH2AX、CHK2和P53。CHK2和P53的激活导致G2/M期细胞停滞。因此，检测点的激活对DNA损伤可能会影响存活的DNA损伤细胞能力，检查点激活的衰减允许癌细胞在DNA损伤的存在下增殖，进一步有助于基因组的不稳定性，导致肿瘤的发生[14-15]。

本实验结果显示，BMI1基因过表达会减弱ETOP诱导的ATM活化，过表达的BMI1基因可大幅减弱ETOP诱导G2期到M期发生阻滞。BMI1的下调对ETOP诱导的防止进入有丝分裂变为敏感。BMI1基因至少从一定程度上衰减了G2/M期细胞周期检查点的活化以及细胞周期的正常阻滞，阻碍了DNA损伤的修复，增加了基因组不稳定性，加剧了肿瘤的进展。本实验结果表明依托泊苷能够显著抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖，能够有效促进MCF7细胞凋亡，并且依托泊苷诱导的MCF-7乳腺癌细胞凋亡与BMI1基因表达下调和ATM基因表达上调相关。在ETOP处理的MCF7 BMI1细胞中，MCF7中BMI1的大幅下降显著增强了ETOP诱导的ATM激活的动力学。此实验结果符合BMI1在促进肿瘤生长中的作用。

总之，BMI1在DNA损伤的存在下有促进癌细胞增殖的作用。这可能会增强基因组不稳定性，并为突变提供癌细胞，从而促进肿瘤的发生。BMI1参与肿瘤的发生及发展多种方式和演进以及与协同基因共同作用的有关机制有待进一步探索。

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（收稿日期：2018-05-06）