雷公藤内酯醇调控COX2/PGE2轴抑制Th17细胞分化的研究

材料和方法

1.1 试剂 人的初始CD4+T细胞磁珠分选试剂盒购自Miltenyi公司；RPMI1640细胞培养液，DMEM高糖细胞培养液购自Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit ）购自Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒（SYBR Premix Ex Taq试剂盒）购自Takara公司；淋巴细胞分离液购自Axis-Shild PoCAS公司；佛波醇酯（Phorbol myristate acetate，PMA）、离子霉素（Ionomycin）、莫能霉素（Monensin）、PGE2均购自Sigma公司；抗人-CD3单抗（anti-hCD3 Ab），抗人CD28单抗（anti- hCD28 Ab），抗人CD4，IL-17A和IFN-γ流式抗体购自biolegend公司；TPT（纯度为99.78%）购自Sigma公司，用DMSO溶解，临用前用细胞培养液稀释至工作浓度，DMSO的终浓度低于0.01%。

1.2 临床标本 滑膜标本取材于广州中医药大学第二临床医学院行关节置换术或滑膜切除术的RA患者6例，诊断符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的RA分类标准，平均年龄（47.6±10.4）岁，均属于活动期，所有患者均已签署知情同意书。

1.3 RASFs的分离培养 无菌获取RA患者滑膜组织，剔除脂肪及纤维组织，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，剪成1 mm×1 mm×1 mm的细小组织块，加入含10%胎牛血清的DMEM完全细胞培养液中（含100 U·mL^-1青霉素，100 mg·L^-1链霉素），5% CO2，37 ℃培养箱内孵育，经0.25%胰酶消化传代，培养至第3～7代的RASFs用于下步实验。

1.4 外周血CD4+T细胞分离 取新鲜采集的健康志愿者外周血，淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMC），然后用MidiMACS免疫磁性吸附柱分离装置和人的初始CD4+T细胞磁珠分选试剂盒对PBMC进行CD4+T细胞分离和纯化，具体操作步骤按照试剂说明，流式细胞术检测CD4+T细胞得率>95%。

1.5 qRT-PCR检测环氧化酶1（COX1）和环氧化酶2（COX2） 用DMEM培养液将RASFs稀释至5×104·mL^-1后铺24孔板，分别加入0，10，50，100 nmol·L^-1的TPT，于24 h后收集细胞上清冻存用于后继的ELISA实验，同时加入1 mL预冷Trizol裂解细胞，提取RNA。经微量核酸定量仪Nanodrop2000检测，A260/A280为1.80～2.0。取1 μg RNA逆转录cDNA。用Takara公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行实时定量检测COX1和COX2的mRNA表达水平，以GAPDH为内源对照，引物序列如下：COX1上游引物AGGGTTTGGCATGAA ACCCTA，下游引物CTCTGCCTCTGCTGCCATCTCCTTCT；COX2上游引物 CTTCAGCACTTCAGCATCAGTTTTTCAAG， 下游引物TCACCGTAAATATGATTTAAGTCCAC；GAPDH上游引物TGTTCGTCATGGGTGTGAACCA， 下游引物GTCATGAGTCCTTCCACGATACCA。按照说明书进行操作，两步法PCR扩增程序进行：第1步，95 ℃，30 s，1个循环预变性；第2步，95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40个循环 PCR反应。反应结束后确认Real-time PCR的扩增曲线和溶解曲线，用相对定量法2-ΔΔCt法分析实验结果。

1.6 ELISA法检测培养上清液PGE2的水平 取冻存的细胞培养上清，按ELISA试剂盒说明书进行操作，最后在全自动酶标仪上读取吸光度A，根据标准曲线求得样品中PGE2的浓度。

1.7 RASFs与健康志愿者 CD4+T细胞共培养 RASFs（2×104/孔） 铺24孔板过夜，TPT干预或未干预24 h后，与异基因的健康志愿者的CD4+T淋巴细胞（2×105/孔）进行共培养，细胞同时用可溶性的抗CD3抗体（1 mg· L^-1）和抗-CD28抗体（500 μg·L^-1）刺激，部分实验中加入外源性的PGE2。1640完全培养基培养3 d后，收集细胞进行胞内细胞因子染色实验。

1.8 细胞内IL-17和IFN-γ染色 RASFs与正常人CD4+T细胞共培养3 d，加入PMA（50 μg·L^-1）、离子霉素（1 mg· L^-1），莫能霉素（1 μmol·L^-1）继续培养4～5 h。用PBS洗涤细胞2次，加入PE-Cy7标记的抗CD4抗体，于4 ℃避光孵育30 min，经固定破膜后加入PE标记的抗IL-17抗体，APC标记的IFN-γ抗体，于4 ℃避光静置30 min。以破膜剂洗涤2次后，重悬细胞，用BD CantoⅡ流式细胞仪检测， FACSDiva软件进行数据分析。

1.9 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据以±s表示，每2组间行t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TPT剂量依赖性抑制RASFs分泌PGE2 RASFs是滑膜组织PGE2的主要细胞来源之一，那么TPT能否抑制RASFs分泌PGE2。ELISA结果显示TPT对RASFs分泌PGE2有明显的抑制作用，且随浓度升高，抑制作用增强（P<0.05），100 nmol·L^-1浓度对PGE2抑制率高达92%（图1）。

与TPT未处理组比较 1）P<0.05，图2，4同。

图1 TPT对RASFs分泌PGE2的影响 （n=6）

Fig.1 Effect of TPT on the secretion of PGE2 in RASFs （n=6）

2.2 TPT抑制COX2的mRNA表达水平 因为PGE2的产生受COX的调控，所以进而本研究用实时定量PCR检测了不同浓度TPT对COX1和COX2 mRNA表达的影响。结果显示TPT呈浓度依赖性抑制COX2的mRNA表达水平（P<0.05），但是对COX1的mRNA表达无影响（图2）。

2.3 TPT干预的RASFs抑制Th17细胞分化 各种浓度的TPT干预RASFs 24 h后，与异基因的健康志愿者的CD4+T淋巴细胞共培养3 d后，收集细胞

图2 TPT对RASFs COX1/2的mRNA表达影响 （n=6）

Fig.2 Effect of TPT on the mRNA level of COX1/2 in RASFs （n=6）

进行多重荧光流式细胞分析。结果显示RASFs促进CD4+T细胞向Th17细胞分化及Th1细胞分化，而TPT呈剂量依赖性抑制RASFs诱导的Th17细胞分化（P<0.05），但不影响Th1细胞分化。

2.4 外源性PGE2逆转TPT干预的RASFs对Th17细胞分化的抑制作用 为了验证TPT干预的RASFs对Th17细胞分化的抑制作用是否是通过下调PGE2的分泌而实现的，本研究在100 nmol·L^-1TPT干预的RASFs与CD4+T细胞共培养体系中加入了外源性PGE2，流式细胞术显示，与TPT干预组比较，外源性PGE2能够明显增加Th17细胞的比例（P<0.05）（图3）。

图3 外源性PGE2对RASFs-CD4+T细胞共培养体系中Th17细胞比例影响 （n=6）

Fig.3 Effect of exogenous PGE2 on Th17 cell differentiation in the RASFs-CD4+T cells coculture system（n=6）

3 讨论

Th17细胞是新近发现的一种效应CD4+T细胞亚群，产生细胞因子如IL-17A，IL-17F和IL-22等，介导组织炎症，在自身免疫疾病如RA中发挥致病作用。中药TPT用于自身免疫疾病如RA取得了较好的疗效，然而既往研究只关注于TPT对Th17细胞的直接抑制作用，而忽略了局部环境对Th17细胞分化的影响。RASFs是滑膜组织的优势细胞，新近多个研究显示RASFs促进滑膜局部组织Th17细胞分化[5， 8-9]，而且RA患者滑膜Th17细胞比例远高于外周血。那么TPT是否能通过RASFs这一中介抑制Th17细胞分化未见报道。TPT预处理RASFs，流式细胞术显示，其诱导Th17细胞分化的能力呈TPT剂量依赖性减弱，说明TPT除了直接抑制Th17细胞分化也能通过RASFs这一中介细胞发挥间接抑制作用。而且值得注意的是这种间接作用是在去除TPT后，RASFs仍然能够抑制Th17细胞分化，说明TPT通过RASFs能够对Th17细胞分化起一个持久的抑制作用，这也提示临床可早期短暂使用TPT通过间接作用抑制Th17细胞分化，从而避免长期使用TPT而导致机体的毒副作用。

PGE2是继TGF-β，IL-6，IL-21，IL-1β，IL-23以后发现的另一种跟Th17细胞分化相关的物质，通过与T细胞表面的EP2和EP4受体结合，促进Th17细胞分化^[6-7]和IL-1β/IL-23介导的Th17细胞扩增^[10-11]。新近研究显示PGE2在RASFs-Th17细胞介导的滑膜炎症中起关键作用^[8]。那么TPT预处理的RASFs抑制Th17细胞分化是否通过调控PGE2而实现。ELISA结果显示，TPT呈剂量依赖性抑制RASFs的PGE2的分泌，提示PGE2是TPT作用的一个下游靶标。而PGE2的产生受环氧化酶（COX）的调控，该酶存在2种异构体即COX1和COX2，COX1组成性表达在大多数组织细胞和血小板中，是维持细胞正常功能不可缺少的，而COX2属诱导型酶，正常组织中很少表达，在各种刺激因素如炎性细胞因子，炎性介质及促癌剂等作用下，其表达则迅速上调^[12]。本实验通过qRT-PCR对RASFs的COX1和COX2的mRNA表达水平进行了检测，结果表明TPT处理组COX2的mRNA表达较对照组明显降低，2组间具有显著性差异，而且COX2的变化趋势与PGE2的变化趋势基本一致。这些结果提示笔者，TPT通过抑制COX2从而下调RASFs分泌PGE2的能力。进一步在RASFs-CD4+T细胞共培养体系中加入外源性PGE2，则可明显逆转TPT预处理的RASFs抑制Th17细胞分化效应，则证实TPT通过调控RASFs分泌PGE2从而抑制Th17细胞分化，从炎症微环境角度阐述了TPT免疫抑制作用的新机制。但笔者也发现外源性PGE2只是部分逆转TPT干预的RASFs抑制Th17细胞分化的效应，提示可能有其他的细胞因子和/或分子参与该过程，则有待进一步研究。

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Triptolide inhibites Th17 cell differentiation via regulating cyclooxygenase-2/

prostaglandin E2 axis in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis

PENG An-ping1， WANG Xiao-yun2， ZHUANG Jun-hua1*

（1.Department of Laboratory Science， Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，

Guangzhou 510120， China； 2.Department of Gynecology， Second Affiliated Hospital of

Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510120， China）

[Abstract] Triptolide （TPT）， an active compound extracted from Chinese herb Tripterygium wilfordii ， has been used in therapy of rheumatoid arthritis （RA）. In this study， after synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis （RASFs） were treated with TPT， we investigated its effect on the differentiation of Th17 cells. Firstly， the mRNA level of cyclooxygenase （COX） wad detected by qRT-PCR and the protein level of prostaglandin E2 （PGE2） was tested by ELISA in RASFs treated with different concentrations （0， 10， 50， 100 nmol·L^-1） of TPT. Then after TPT pre-treated RASFs and RA CD4+T cells were co-cultured for 3 days in the presence or absence of PGE2， IL-17 and IFN-γ production in CD4+T cell subsets were detected by flow cytometry. The results showed TPT decreased the mRNA experssion of COX2 and the secretion of PGE2 in RASFs in a dose-dependent manner（P<0.05）. We further found that differentiation of Th17 cells was dowegulated in a dose-dependent manner， and exogenous PGE2 could reverse the inhibition of Th17 cell differentiation（P<0.05）. Taken together， our results demonstrated that TPT inhibited the mRNA level of COX2 and the secretion of PGE2 in RASFs， which partly led to impaired Th17 cell differentiation in vitro.

[Key words] triptolide； Th17 cells； prostaglandin E2； synovial fibroblasts

doi：10.4268/cjcmm20140334

[责任编辑 陈玲]