链霉菌I06A—02580发酵产物的分离提取及其结构鉴定

[摘要] 目的 从链霉菌I06A-02580中提取分离和纯化小分子血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体抑制剂，并进行结构鉴定。 方法 以酪氨酸酶活性测定方法即酶联免疫吸附测定法（ELISA法）为活性跟踪方法，利用大孔吸附树脂方法、高效液相色谱（HPLC）等方法进行分离纯化。利用紫外（UV）、红外（IR）、质谱（MS）和核磁共振（NMR）四谱联合分析，进行结构解析。 结果 分离纯化到两个已知化合物大豆苷元和染料木素并具有相关活性。 结论 大豆苷元和染料木素为已知化合物，大豆苷元对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有抑菌作用；染料木素有抗真菌的作用。该研究为首次报道该化合物具有VEGFR拮抗活性。

[关键词] 血管内皮细胞生长因子；分离纯化；结构鉴定；抗肿瘤

[中图分类号] R915 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（c）-0021-03

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种糖基化分泌性多肽因子，是作用最强的促血管生长因子[1]，血管内皮细胞生长因子受体（KDR）是介导VEGF在肿瘤新生血管形成中发挥功能的特异性受体[2]。恶性肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管新生，VEGF和KDR在正常组织中少量表达，在恶性肿瘤组织中的表达高于良性，且随着恶性程度的进展，VEGF和KDR的表达增加[3]。VEGF受体KDR既表达于肿瘤新生血管内皮细胞， 又表达于大部分恶性度较高的肿瘤细胞[4]，因此，以肿瘤血管为靶点，采用各种途径抑制肿瘤血管的形成，能有效抑制肿瘤生长和转移[5]。KDR由含7个胞外Ig样结构域、1个单一短链跨膜系列和1个具受体酪氨酸激酶活性的胞内区（KDR-CD）组成。美国学者Jame等[6]和Genshi等[7]的研究表明，KDR抑制剂对KDR-CD同样具有抑制活性，并认为以KDR-CD作为靶点建立高通量酪氨酸激酶抑制剂筛选模型是可行的，但目前相关的研究结果报道较少，微生物来源的酪氨酸激酶抑制剂研究也较少。有研究发现VEGFR抑制剂可促进肿瘤细胞凋亡，使其活力下降，目前已有多个酪氨酸激酶抑制剂药物上市，如舒尼替尼（Sunitinib）、阿西替尼（Axitinib）、西地拉尼（Cediranib）、二磷酸莫替沙尼（Motesanib）、帕唑帕尼（Pazopanib）、伐地他尼（Vandetanib）、索拉菲尼（Sorafenib）、瓦他拉尼（Vatalanib）等。本研究采用本所生物工程室以KDR-CD蛋白为靶位，建立的VEGF受体抑制剂筛选模型对菌种I06A-02580的次级代谢产物进行了研究。

1 材料与仪器

1.1 菌种

链霉菌 I06A-02580 由中国医学科学院医药生物技术研究所菌种保藏中心提供。

1.2 试剂和材料

X-5大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；葡聚糖凝胶 LH-20（上海化学试剂厂，进口分装）；丙酮，甲醇等均为北京化工厂生产，分析纯；乙腈（SK Chemicals 公司，色谱纯，韩国）。

1.3 仪器

傅里叶变换红外光谱图仪（nicolet5700，热电公司，美国）；质谱仪（LTQ-Orbitrap赛默飞世尔，美国）；核磁共振仪（Varian VNS-600 型 600M，瓦里安公司，瑞士）；中压液相色谱仪（EPCLC AI-580S，山善公司，日本）；中压液相色谱柱（ODS-SM-50B，26 mm×300 mm，山善公司，日本）。高效液相色谱仪（Agilent 1200A，安捷伦公司，美国）；半制备色谱柱（9.4 mm×250 mm，5 μm，安捷伦公司，美国）；分析色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，安捷伦公司，美国）；紫外光谱仪（UV 2550 型，岛津公司，日本）；高速离心机（6-16K，SIGMA公司，德国）；恒温摇床（HZQ-Q 型，江苏金坛市环宇科学仪器厂，中国）；无菌工作台（SANYO MCV-B161Sb（T），三洋电气公司，日本）；电子分析天平（HANGPING FA 1004 上海天平仪器厂，中国）；旋转蒸发仪（Buchi-011，瑞士）；冷冻干燥仪（Alphr 2-4 lscChirst 公司，德国）。

2 方法与结果

2.1 菌种I06A-02580的发酵

链霉菌I06A-02580于斜面培养基培养7 d（28℃）。无菌操作下，将生长于新鲜斜面的I06A-02580挖块接种于100 mL种子培养基于500 mL摇瓶中，28℃，250 r/min旋转震荡48 h。二级发酵：无菌操作下，以5%的接种量将种子培养液转种于装有1 L液体培养基的5 L玻璃摇瓶中，28℃，250 r/min摇床培养96 h，获得发酵液。

2.2 提取分离

将菌种I06A-02580发酵液离心（4500 r/min，15 min），弃去菌丝体，上清液用X-5 大孔吸附树脂色谱柱洗脱，分别用两倍体积的无盐水、10%、30%、50% 和80% 的丙酮水溶液进行洗脱。活性测试结果显示，50%丙酮水洗脱液活性较好。将这一部分洗脱液减压旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥。冻干粗品用少量溶剂（无盐水∶甲醇=1∶1）溶解，上样于Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱，以70% 甲醇水为流动相进行洗脱，跟踪活性，收集活性带，得到半纯品A，将A用少量50%乙腈水溶液溶解，用HPLC进行制备（色谱柱：9.4 mm×250 mm，5 μm），流动相为35% 乙腈水溶液，流速 1 mL/min，检测波长215 nm，收集单一组分，减压旋转浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥，得到类白色粉末2580A、2580B。

3 讨论

大豆苷元和染料木素都属于异黄酮化合物，原发现于豆类植物和齿状植物中，后相继有报道从链霉菌[10]、嗜盐小单孢菌[11]、海洋小单孢菌[12]、游动放线菌[13]、假单孢菌[14]和真菌的发酵产物中分离得到。研究发现大豆、三叶草、葛根、槐花、槐角、金雀花和广豆根等豆科植物中都含有染料木素，以大豆中含量最为丰富。1899年，Perkin等[15]从金雀花中第1次分离得到了染料木素。

大量的研究发现以大豆苷元和染料木素为主要成分的大豆异黄酮类具有非常广泛的生物学活性，由于分子的相对两极带有两个酚羟基， 结构和分子量与雌二醇类似， 能低亲和地结合雌激素受体，介导雌激素样作用。除了雌激素样作用外，还具有抗氧化、调节细胞周期等功能。另外文献报道，大豆苷元和染料木素对屎肠球菌的耐药菌株（VRE）具有微弱的抗菌活性，染料木素对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌有微弱作用[13]。

近几年，能够破坏或抑制血管生成、有效地抑制肿瘤生长和转移的药物，是新型抗肿瘤药物研究的活跃领域之一[16]。例如去甲斑蝥素，它可有效抑制、破坏胆囊癌肿瘤血管生成，进而抑制胆囊癌的增殖与生长；贝伐单抗（Bevacizumab，Avastin）能特异性阻断VEGF的生物效应，抑制肿瘤内血管新生。尽管目前靶向治疗药物联合已确立了它的治疗地位，但是抗血管生成药物的联合治疗在未来的肿瘤治疗中将发挥重要的作用。

研究表明，大豆苷元和染料木素对前列腺癌、乳腺癌等肿瘤均有抑制作用，且毒副作用少[17]。染料木素还具有不杀伤正常细胞的特点[18]，但2010年Hu等[19]发现，染料木素可能有潜在的生殖毒性，因而这一类化合物受到医药界的关注。目前抗癌药物的研发，相当一部分是以天然抗癌活性组分为先导化合物进行研发的[20]，所以VEGFRs小分子抑制剂也是近几年抗肿瘤新药研发的热点。

本研究首次报道了大豆苷元和染料木素具有KDR-CD的抑制活性，证实了KDR-CD抑制活性同肿瘤抑制活性具有相关性。本研究所得到的染料木素和大豆苷元是链霉菌发酵产物，可为今后从微生物发酵产物中筛选和研究新型KDR抑制剂开辟思路，但是机体内肿瘤组织血管的生成与调节是一个复杂的、多因素综合作用或调节的结果， 要完全阐明其机制并通过抑制血管生成达到治疗肿瘤的目的还需要进行更深入的研究。

[参考文献]

[1] 刘宣，王炎，李丹光，等.丹参酮ⅡA对COX-2激活Wnt/β-catenin信号通路介导的人肠癌细胞VEGF表达的调控作用[J].中华中医药杂志，2013，28（1）：108-112.

[2] Tsumuraya M，Kato H，Miyachi K，et al. Comprehensiveanalysis of genes involved in the malignancy of gastrointestinalstromal tumors [J]. Anticancer Res，2010，30（7）：2705-2715.

[3] 曹宁川，杨娜.VEGF、KDR在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达及其与血管新生的关系[J]. Seek Medical And Ask The Medicine，2012，10（4）：22-23.

[4] 刘志毅，宋艳，武洪斌，等.KDR启动子启动双自杀基因对LOVO细胞的杀伤作用[J].Chin Lab Diagn，2008，12（1）：50-53.

[5] Sharma S，Murphy AJ，Soto-Quiros ME，et al. Association ofVEGFpolymorphisms withchildhood asthma，lung function and airwayresponsiveness [J]. Eur Respir J，2009，33（6）：1287-1294.

[6] James Solowiej，Simon Bergqvist，Michele A. Characterizing the effects of the juxtamembrane domain on vascular endothelial growth factor receptor-2 enzymatic activity，autophosphorylation，and inhibition by axitinib [J]. Biochemistry，2009，48（29）：7019-7031.

[7] Genshi Zhao，Robert B，Jonathan MY. Characterization and development of a peptide substrate-based phosphate transfer assay for the human Vascular endothelial growth factor receptor-2 tyrosine kinase[J].J Med Chem，2007，360：196-206.

[8] Rooke N，Li DJ，Li JQ. The mitochondrial monoamine oxidase-aldehyde dehydrogenase pathway：a potential site of action of daidzein[J]. J Med Chem，2000，43：4169-4179.

[9] Tanaka H，Koyama Y，Nagai T. Nanaomycins，new antibiotics produced by a strain of Stheptomyces.Ⅰ.Taxonomy，Isolation，Characterization and biological properties [J]. J Antibiot（Tokyo），1975，28（11）：868-875.

[10] Hazato T，Naganawa H，Kumagai M，et al. Betagalactosidase-inhibiting new isoflavones produced byactinomycetes [J]. J Antibiotic，1979，32（3）：217-222.

[11] Ganguly AK，Sarre DZ. Genistein and daidzein，metabolites of Micromonospora halophytica [J]. ChemInd，1970，6： 201.

[12] Jiang H，Cheng YR，Zheng W. Daidzein and genistein produced by a marine Micromonospora carbonacea FIM 02635 [J]. 中国海洋药物杂志，2007，26（1）： 8-12.

[13] 董国霞，孙薇，张玉琴，等.Actinoplanessichuanensissp.novI03A-00723发酵产物的分离纯化、结构鉴定与生物活性研究[J].中国抗生素杂志，2011，36（2）：107-112.

[14] Rabiau N，Kossai M，Braud M，et al. Genistein and daidzein act on a panel of genes implicated in cell cycle and angiogenesis by polymerase chain reaction arrays in human prostate cancer cell lines [J]. Cancer Epidemiology，2010，34（2）：200-206.

[15] Perkin AG，Newbury FG. The colouring matters containedin dyer’s broom（Genista tinctoria）and heather（Callunavulgaris）[J]. J Chem Soc，1898，75：830.

[16] 张永莉.肿瘤新生血管生成抑制剂的研究进展[J].中国药房，2008， 19（31）：2465-2466.

[17] Rao CV，Wang CX，Simi B. Enhancement of experimental colon cancer by Genistein [J]. Cancer Research，1997，57： 3717.

[18] Seo YJ，Kim BS，Chun SY，et al. Apoptotic effects of genistein，biochanin-A and apigenin on LNCaP and PC-3cells by p21 through transcriptional inhibition of polo-likekinase-1 [J]. J Korean Med Sci，2011，26（11）：1489.

[19] Hu G，Zhao B，Chu Y，et al. Effects of genistein andequol on human and rat testicular 3β-hydroxysteroid dehydrogenaseand 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3 activities [J]. Asian J Androl，2010，12（4）：519.

[20] 罗艳萍，修连喜.天然抗肿瘤药物的研究进展[J]黑龙江医药，2011， 24（3）：377-380.

（收稿日期：2013-05-23 本文编辑：卫 轲）