p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在应力调控成肌细胞分化中的作用

[摘要] 目的 研究在C2C12细胞成肌分化过程中应力对丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路中p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路的影响。方法 将6孔Bio Flex培养板上贴壁培养的C2C12细胞，以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度，分别进行拉伸培养2、6、12、24 h，应用Western blot免疫印迹检测总p38和磷酸化p-p38（Thr180/Tyr182）蛋白的表达情况。结果 周期性机械拉伸在调控C2C12成肌细胞分化过程中，p38MAPK信号通路

被激活。p38MAPK信号通路蛋白磷酸化水平在较高水平；而p38MAPK通路总蛋白表达维持在一基线水平，各组之间差异无统计学意义。加入p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580后再加力，Myogenin的表达明显降低。结论 p38MAPK信号通路在应力介导的C2C12成肌细胞分化过程中发挥重要作用，但不是这一调控过程的唯一通路。

[关键词] p38丝裂素活化蛋白激酶； 分化； 成肌细胞

[中图分类号] Q 257 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.004

在骨骼肌的发育过程中，成肌细胞发生两方面的成肌变化，一方面是成肌细胞增生；另一方面是增生的成肌细胞分化。成肌细胞的增殖和分化不仅是发育中形态构建的重要机制，也是成体形态维持的重要机制，这两者都受外界信号的调节。其中力学信号是骨骼肌形成和再生的重要外界因子[1-2]。但成肌细胞如何感知力学信号，从而特异性地激活其信号转

导途径，影响调控成肌调节因子（myogenic regulatory

factors，MRFs）的表达，对肌卫星细胞增殖分化的潜能发挥效应，目前还不得而知。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）级联反应是细胞内重要的信号传导系统之一。到目前为止，在真核生物细胞中已明确了5条MAPKs通路，分别为细

胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated

protein kinase，ERK）通路、c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）通路、p38丝裂素活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated

protein kinase，ERK）3/4和ERK5亚家族。研究发现：p38MAPK能被多种细胞外的刺激因素激活，包括机械压力、炎症性细胞因子及生长因子等[3-4]。p38MAPK是p38MAPK通路中的核心蛋白，它的活性受其上游丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein

kinase kinase，MAPKK）的调控。MAPKK通过磷酸化p38MAPK蛋白Thr-Gly-Tyr（TGY）位点中的苏氨酸和酪氨酸使其活化，活化的p38MAPK进一步磷酸化下游的蛋白激酶和转录因子，调控多种基因的表达，从而参与调控p38MAPK信号通路。本实验旨在研究在应力介导的C2C12细胞成肌分化过程中，应力对MAPKs信号通路中p38MAPK信号通路的影响；并通过观察p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580对C2C12细胞成肌分化的影响，进一步明确p38MAPK通路在应力诱导C2C12细胞成肌分化中的作用，为阐明应力诱导成肌细胞分化的力学信号转导机制提供实验学基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C2C12小鼠成肌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM高糖培养液（Hyclone公司，美国），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），胰酶-乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）（北京Solarbio公司），SB203580（Sigma公司，美国），p-p38（Thr180/Tyr182）antibody、p38

antibody（Cell signaling公司，美国），HRP标记羊抗兔IgG、Myogenin/β-actin（Santa Cruz公司，美国），6孔Bio Flex特制细胞培养皿（Flexcell公司，美国），多通道细胞牵张应力加载系统（哈尔滨工业大学研制），

Bio-rad凝胶成像系统（BIORAD Gel Doc2000，Bio-rad公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 C2C12小鼠成肌细胞力刺激培养模型的建立

取传至第3代生长良好的C2C12小鼠成肌细胞，胰酶消化后吹散，细胞计数后调整浓度至每毫升5×104个，接种于6孔Bio Flex特制细胞培养板中，每孔加2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。培养板上细胞贴壁培养48 h后，将生长培养基换为分化培养基，在分化培养基中继续培养1 d，以促进细胞分化，让细胞充分融合（细胞融合接近85%），并同步化，避免细胞融合

对实验结果的影响。然后在无菌条件下，将培养皿与多通道细胞牵张应力加载系统连接，对卫星细胞施加不同时间的张应变刺激。各加力组每天分别对待测细胞加载2、6、12、24 h的张应力和压缩力，力值为10%，频率为0.5 Hz。对照组放在同一孵箱内进行培养，不进行离心加力，其余条件相同。实验组与对照组同时种板，各重复3次。

1.2.2 阻断剂预处理及细胞加载方案 为进一步明确p38MAPK信号通路在C2C12成肌细胞分化中的作用，将p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580加入实验组，按说明书的要求将阻断剂稀释为20 μmol·L-1，保存待用。在6孔Bio Flex培养板上贴壁培养48 h并同步化后，换用含有阻断剂的DMEM培养液对细胞进行预处理，然后以0.5 Hz的加载频率和10%的细胞拉伸变形幅度进行拉伸培养24 h。对照组放在同一孵箱内进行培养，不进行离心加力，其余条件相同。各组重复3次，加力结束后分别收获细胞。