基因工程植物疫苗的研究进展及应用

摘要：基因植物疫苗已成为疫苗研究领域的一个新热点,本文简单介绍了植物疫苗的免疫原理、植物疫苗的特点、植物疫苗生产的表达系统、以植物为载体的免疫技术、植物疫苗的安全性、植物基因工程疫苗研究进展、基因工程在植物疫苗中的应用以及展望等。

关键词：植物疫苗；基因工程；表达系统；安全性

1 植物疫苗的免疫原理

植物疫苗可诱导粘膜免疫反应，小肠淋巴组织的粘膜上有一种特殊的细胞叫做膜细胞（M 细胞）。粘膜免疫应答就是由M 细胞识别抗原开始的。M细胞识别抗原并将其传递给巨噬细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞，再将抗原展示给辅助性T细胞，辅助性T细胞识别外源蛋白质片段后就会刺激B细胞制造和释放能中和抗原的抗体，当疾病因子出现时，记忆辅助性T细胞刺激胞毒T 细胞攻击受感染的细胞，同时它迅速刺激记忆B 细胞分泌中和抗体消灭入侵的病原体。总的来说，转基因植物疫苗可以诱导相应的血清型的IgA 和IgG 反应。

2 植物疫苗的特点

2.1 安全性高

植物是人类食物来源之一，除个别人群对某些特定的植物过敏外，其安全性高。用动物细胞生产疫苗，可能有动物病毒的污染，对人类存在潜在危害。而植物病毒不会感染人类，比较安全，同时也可避免微生物生产疫苗带来的有害产物。

2.2 成本低

植物种植系统简单易行，植物细胞培养条件简单，便于进行遗传操作，可通过大面积栽培获得廉价的疫苗，且不需要技术、设备和种植条件等巨大投资。农作物可以当地生产，还易于储藏和运输，而且经过长期种植，植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形成工业化。与植物生物反应器相比，原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的技术设备、大量的人力物力。

2.3 植物具有完整的真核表达系统

具有与动物相同的真核加工修饰系统。可以对重组蛋白进行糖基化、磷酸化、酰胺化、亚基正确装配等。微生物系统不能对真核生物蛋白进行正确的翻译后加工。

2.4 转基因植物中的外源基因可重组

通过植物杂交的方法进行基因重组，进而在植物体内积累多种病原体的抗原基因，生产出方便高效的多联疫苗。

3 植物基因工程疫苗外源基因的表达系统

3.1 瞬时表达系统

主要采用植物病毒作为载体，而外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒感染植株，从而将外源基因导入植物细胞内，采用这种转化方式，外源基因并不整合至植物基因组中，只是利用寄主细胞在细胞质中进行复制，以高拷贝的形式游离于植物中，并进行高效的表达，因此可在短时间内在植物细胞内积累大量的外源蛋白。采用农杆菌介导的转化，外源基因蛋白的产量一般要低于细胞内可溶性蛋白总量的1%；而采用这种瞬时表达系统,外源基因蛋白总量会远大于1%。

3.2 稳定整合系统

3.2.1 土壤农杆菌介导的遗传转化。目前根癌农杆菌主要用于双子叶植物的遗传转化，其转化植物的机制已从分子水平上基本得到解释。而发根农杆菌，由于对Ri 质粒了解得还不充分，所以对这种转化系统的研究主要集中在以生产次生代谢产物为目的的根组织培养和根的发育。采用农杆菌介导的植物转化最常采用共培养法，即使用农杆菌菌液与叶盘、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎段、下胚轴段、子叶切片等部分进行共培养，从而达到转化的目的。

3.2.2 外源DNA 直接导入法。主要包括基因枪法、电激发、PEG诱导法、激光穿孔法、脂质体法、超声波法，其中最常用的是基因枪法。它是将带有外源基因的质粒用亚精胺包裹为直径1μm 左右的金弹或钨弹，再用高压氦气、火药爆炸力、高压放电气体作为动力加速子弹，使它们穿过植物细胞壁和细胞膜，将外源基因带入具有再生能力的植物组织，这样可以在很大程度上缩短再生的时间，从而避免体细胞变异的发生。

4 以植物为载体的免疫技术

4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保护作用

由于植物疫苗一般是通过食用来被人体利用。所以如何避免消化酶的影响来保护抗原就是一个重要的研究课题。目前，避免消化酶的影响来保护抗原可分为2类方法：①用沙门氏菌和弧状霍乱杆菌作为载体；②用保护性的包被对抗原进行包装。

用减毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系统摄取所表达的抗原。但是基于减毒菌株的方法具有潜在安全缺陷，而后者可通过生物降解的多聚物、脂质体、蛋白质体或者表达抗原的转基因植物来实现。许多研究表明，植物材料可潜在地保护所选定的抗原。特别在种子中，植物可为亚单位疫苗提供一个富含蛋白酶抑制物的糖类聚合物基质环境。其它的抗原包装方法需要烦琐的处理步骤；而通过植物种子来进行生物包装不需要任何额外的代价，就可以为这些抗原提供保护。在有关转基因马铃薯的研究中，从轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌中所选的抗原分别与霍乱毒素的B和A2亚单位融合，抗原的免疫反应显示出对Th1的偏爱性，并可诱导白细胞介素2和干扰素γ，CD4 + 水平也相应增加。Th1的偏爱性很可能是抗原或者载体的选择结果。在佐剂的帮助下，亚单位疫苗的释放能增加免疫反应量。霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定毒素，它们与抗原共表达，有利于诱导保护性的免疫产生，改变口服免疫低效率递呈。另外，有人证实了转基因植物疫苗的粘膜传输中所诱发的免疫应答所具有的黏膜佐剂的特征，这给口服免疫可不需佐剂提供了依据，同时也提高了其安全性。

在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候选的亚单位疫苗也具有较好的保护作用。马铃薯块茎或谷物种子中表达的热不稳定毒素的B 亚基和马铃薯中表达的霍乱毒素B 亚基用于小鼠口服免疫，可以保护老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物种子表达的传播性肠炎病毒的S2糖蛋白，对乳猪能够起到很好的保护作用。目前，通过植物递送系统来生产B 型肝炎的疫苗也逐渐成熟。

4.2 提高抗原在植物中的表达水平

利用植物进行疫苗开发，首要的问题是，植物能否表达相关的蛋白？目前为止，许多亚单位候选抗原在转基因植物中成功表达，这些抗原主要包括感染人类、家畜、野生动物的细菌和病毒抗原。表达水平很大程度上取决于表达的蛋白和用于表达的植物种类，同时，构建的表达系统也影响抗原的表达水平，比如用于表达的细胞器基因组(核和质粒)、启动子的强度和组织专一性、非翻译前导序列和信号序列的选择和表达蛋白的靶细胞器的定位等均对表达产生影响。一般而言，利用上述策略可以实现抗原高水平表达。然而，很难对表达系统进行比较，因为特定抗原对植物表达系统的选择很重要，在不同的系统中其表达效果是不一样的。近来，研究人员利用内质网滞留信号可提高外源基因的表达量，Mason等利用一个核表达系统，把蛋白定位于内质网滞留信号之后，热不稳定毒素B亚单位在马玲薯块茎中表达量可达总可溶性蛋白质的0.2% ；在谷物种子中的表达量约占总可溶蛋白的4%或12% ，这些都依赖于所用的调节序列。另外，霍乱毒素（B）亚单位在利用内质网滞留信号时在烟草叶片中的表达量约占总可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更难于在转基因植物中表达，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表达量远不及可溶性蛋白，这就需要优化表达系统以提高表达水平。

目前，转基因马玲薯表达B型肝炎的表面抗原水平已由马玲薯大约1mg/g增加到马玲薯大约16mg/g抗原，这样可以大大减少口服剂量。目前许多研究表明，所欲表达的抗原在植物中能够表达并装配成四级结构。糖基化修饰的蛋白也可在植物中进行糖基化，尽管糖基化模式很可能存在着差别。在植物系统中表达的热不稳定蛋白毒素的B亚单位和霍乱毒素的B亚单位，均有GM1受体结合活性，B型肝炎表面抗原和诺沃克病毒衣壳蛋白可形成类病毒颗粒，类病毒颗粒的形成，可认为有利于诱导免疫反应。

5 植物基因工程疫苗研究进展

5.1 反转录病毒载体

反转录病毒作为载体是在进行动物基因工程中发现的，许多研究人员认为它同样适于植物基因工程，但目前研究的不多。

5.2 单链RNA植物病毒

单链RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作为mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花叶病毒(ALMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。它们作为外源基因载体主要通过以下步骤感染植物：病毒RNA 首先反转录为一条单链cDNA，在DNA聚合酶作用下形成双链DNA，将其克隆入细菌质粒中，将外源基因插入质粒的cDNA中，最后通过体外转录，用带有外源基因的RNA病毒感染植物，将其转入植物细胞。

5.3单链DNA植物病毒载体

在单链DNA 植物病毒载体中，研究最多的是Geminiviruses(简称GeNV) ，又叫做双粒病毒或双联体病毒。它一般含有2个成对并存的病毒颗粒，大小约为18～20nm，遗传物质是单链DNA ,每2个颗粒中包含1～2个、2. 5～3.0 kb的环状DNA分子。该病毒寄主广泛，单子叶植物和双子叶植物均可被感染，但感染部位仅限于植物的维管组织，且其传播媒介主要是昆虫，不能通过机械接种。

5.4 双链DNA植物病毒载体

双链DNA植物病毒载体中最典型的是花椰菜花叶病毒，它的基因组长约8kb，主要感染花椰菜、油菜、拟南芥等，主要寄主是芸苔属植物，目前尚未发现可感染豆科和单子叶植物。

6 植物疫苗的安全性

6.1 对环境的影响

由于在植物疫苗中包含了病原体的DNA片段，因而花粉和种子的散播造成的基因逃逸可能给人类带来新的病原、毒素、过敏原等，因此对可能引起的基因渐渗现象必须做出充分的安全性评价,并规范植物疫苗的利用和管理，同时寻求技术方法。如可恢复性功能阻塞(RBF)技术，它能使自然界中因渐渗而携带RBF 的杂种或近缘系植物死亡或不育或利用叶绿体转化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，这样就可避免花粉传播而带来的潜在威胁，转基因植物疫苗有着传统疫苗无法比拟的优越性，已经成为一个研究热点了。未来的研究应着眼于生产出作为医药商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。转基因植物疫苗应用最大的限制就是表达量低。现在的研究表明：可以通过叶绿体转化、植物育种和利用食品加工技术来提高表达水平，而且研究还指出，运用携带蛋白和辅助蛋白可以增加抗原被免疫系统识别的能力。这些研究都使我们越来越接近生产出廉价“安全口服的商品植物疫苗”，这样的疫苗将可以帮助人们预防疾病的传播。

6.2对人类和动物的影响

抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因。长期食用这类转基因疫苗是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效。转基因植物中的新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物，引起菌群和数量的变化或插入并表达，从而危害人畜健康？这些问题目前都无法解答，仍需大量学者继续研究论证。

7 展望

利用植物来表达和递送疫苗技术的发展给免疫研究注入了新的内容。以往的研究中,在植物中表达了包括过滤性病毒、细菌、肠道和非肠道的病原体等各种不同的抗原，并做了相应免疫学研究。但植物疫苗面临的最大问题是抗原蛋白在植物细胞表达量不高，低剂量抗原蛋白往往不能激发足够的免疫反应，这不能仅靠增加植物组织摄取量得以解决，因为低剂量的重复免疫可能会导致机体的免疫耐受，导致机体对此抗原免疫反应保持“低调”，即使以后增加抗原蛋白的剂量也不能改变。另外，机体每天对植物组织的摄取量是一定的，不可能无限增加。因此，未来研究的重点之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表达量。随着生物技术的发展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗递送系统将更具吸引力，并呈现出广阔的应用前景。

参考文献

1 余祖华，王红宁.用植物生物反应器研制基因工程疫苗的进展[J].生

物技术，2004（8）

2 谭向红. 21世纪初基因工程现状与发展趋势[J].四川农业大学学报，2002（6）

3 丰震.食用疫苗研究进展[J].生命科学研究，2001（11）

（责任编辑 舒丹丹）