臭牡丹含药血清对人肝癌MHCC97-H细胞周期和凋亡的影响

[t�P���n�*'N����{Z�x��ǫ�j W��קv�'��z'��蚋^����m�Ȭ��/{�j�&iǥ�Ƨv�޽���zY\��^N�y�Z�+&���z��jם�����.��b�Zƚ��v�'��.��b�\�jk�ע���i��rا��^��b���k�r]����� +v��z�zwk�pn��ǥ�\��&k�^�G����r]�����^uzk�ע�ǥ�̜�橢�h�+?�����"http://www.wufanghuizhong.com/p/baogao/" target="_blank" class="keylink">报告2018》中数据显示，我国肝癌新增患病人数居世界首位，5年实际生存率仅约为33%，死亡人数高达全球死亡人数的42%[1]。目前肝癌治疗首选是手术，但因其起病隐匿、进展迅速，往往发现时就已是中晚期，失去手术机会，即使10%～20%小部分行手术切除患者，术后复发的比例仍然高达57%～81%，术后2年复发率甚至达70%以上[2]。所以寻找对肝癌低毒高效的药物是改善肝癌疗效及预后的重要研究方向之一。臭牡丹是我国著名中医药学家欧阳锜研究员发掘出的民间治疗恶性肿瘤单方，一直被湖湘欧阳氏杂病流派传承人习用于各种恶性肿瘤的治疗。其效活血散瘀、祛风解毒、消肿止痛，与肝癌“化瘀解毒、消瘤散结”的中医治疗原则相符合。课题组结合多年的临床经验和科研实践，通过前期体内外实验研究，发现臭牡丹可以抗肝癌的发生发展[3-6]，但细胞凋亡相关机制较少涉及，也罕见文献报道。本研究选取人肝癌MHCC97-H细胞株，从细胞凋亡因子Bcl-2和Bax为切入点，观察臭牡丹含药血清对肝癌MHCC97-H细胞凋亡和周期的影响并探讨其抗肝癌的可能机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1  动物

实验动物选取20只6～8周龄SPF级雄性健康SD大鼠，采购于湖南斯莱克景达实验动物公司，体质量控制在250～280 g，动物许可证号：SYXK（湘）2013-0005。

1.2  细胞

人肝癌细胞株MHCC97-H（库号：ZQ0020）采购于上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.3  药物

从湖南省中医药研究院附属医院中药房购臭牡丹饮片，依照《湖南省中药材标准》，鉴定为马鞭草科大青属植物臭牡丹Clerodendrum bungei Steud.的地上部分。

1.4  主要试剂与仪器

胎牛血清（美国Gibco公司，批号：10099141），胰酶消化液（碧云天公司，批号：C0201），DMEM培养基（美国Gibco公司，批号：11965-092），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基，批号：KGA106），Bcl-2、Bax、β-actin 抗体（美国Proteintech公司，货号分别为：60178-1-Ig、50599-2-Ig、60008-1-Ig）。电泳仪（美国Bio-rad公司，164-5050），DSZ2000X倒置生物显微镜（中国北京中显恒业仪器厂），Cyto FLEX流式细胞仪（美国Beckman公司），DYCZ-40A转膜仪（中国北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1  臭牡丹提取物的制备

用臭牡丹饮片适量，加水回流提取2次，第1次加12倍量水，浸泡1 h，回流提取1 h，第2次加7倍量水，回流提取1 h，滤过，合并滤液，浓缩至每毫升相当于2 g生药，加入95%乙醇，调整含醇量为60%，沉淀24 h后进行抽滤，滤液回收乙醇至无醇味，继续浓缩至每毫升浸膏相当于5 g生药（经换算，每1 g浸膏相当于臭牡丹生药4.14 g），灌装，灭菌，即得。

2.2  含药血清的制备

20只雄性SD大鼠随机分成4组，每组5只。即模型组和臭牡丹提取物高、中、低剂量组。臭牡丹提取物根据60 kg成人体质量0.5 g/kg臭牡丹生药用量计算，高、中、低剂量分别为2.18、1.09、0.55 g/kg，模型组给予生理盐水。小鼠每日进行2次灌胃，第3天末次给药1 h之后，乙醚进行常规麻醉，然后腹主动脉取血，分离血清。将同组大鼠血清混合均匀，过滤后储存以供之后实验使用。

2.3  细胞形态的观察

常規培养MHCC97-H细胞至对数生长期，次日加入15%浓度的高、中、低剂量组含药血清进行培养，48 h后显微镜下观察各组含药血清干预后细胞的形态学变化。

2.4  细胞凋亡的检测

待药物分别干预48、72 h后，用PBS洗后，过300目筛，重悬细胞于Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V-FITC及Propidium Iodide混匀，在避光条件下室温反应5～15 min，1 h内进行流式细胞仪检测。

2.5  细胞周期的检测

待药物干预细胞72 h之后，对细胞悬液进行收集，离心后得细胞沉淀，用PBS液洗涤2～3次，加入预冷的100%乙醇1.2 mL，使其终浓度为75%，4 ℃ 放置过夜固定。固定后将乙醇溶液去掉，加入 PI（碘化丙啶）工作液150 μL，在4 ℃避光条件下染色30 min。转至流式检测管，进行检测。

2.6  Western blotting测定Bax和Bcl-2蛋白的表达水平

待药物干预细胞72 h之后，严格遵照BCA蛋白定量试剂盒（Wellbio）的操作步骤进行实验，将细胞总蛋白进行分离和提取，用苯二甲苄基氯化铵蛋白浓度测定法对蛋白进行定量。用化学发光试剂曝光显影，扫描底片，蛋白相对表达量以灰度值比值表示。

2.7  统计学处理

SPSS 21.0统计软件处理，计量资料以“x±s”表示，并进行正态性及方差齐性检测，符合正太性及方差齐性则使用单因素方差分析，如不满足，则进行秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1  臭牡丹含药血清MHCC97-H细胞形态的影响

倒置显微镜下，模型组MHCC-97H细胞贴壁良好，胞浆丰富，呈多边形，相邻细胞生长融合成片;臭牡丹各组干预后，细胞形态发生变化，细胞变得稀疏杂乱、折光性增强，培养基中漂浮的细胞增多，中、高剂量组尤为明显。见图1。

3.2  臭牡丹含药血清对MHCC97-H细胞凋亡的影响

高剂量组与模型组相比，MHCC97-H细胞的凋亡比例明显增加。相同剂量药物干预48 h和72 h诱导凋亡的效果差异不明显，模型组48 h和72 h的凋亡率分别为8.35%、8.31%，与臭牡丹组各时间段最大凋亡率19.48%、19.72%比较，差异显著（P<0.05）。见图2和图3。

3.3  臭牡丹含药血清对MHCC97-H细胞周期的影响 臭牡丹含药血清干预后各剂量组S期细胞比例降低，与模型组比较，有显著差异（P<0.05），中、高剂量组G2/M期细胞明显增多（P<0.05）。各剂量组G0/G1期细胞与模型组比较，无明显变化，提示臭牡丹含药血清阻滞细胞由G2/M期进入G0/G1期，进一步减少S期，干扰DNA复制，从而抑制细胞增殖。见表1。

3.4  臭牡丹含药血清对凋亡相关因子Bax和Bcl-2蛋白的表达的影响

Western blotting 结果显示，Bax蛋白表达量显著增加，以中、高剂量组尤为明显（P<0.01）。而Bcl-2蛋白的表达量均减少，高剂量组最为明显，与模型组相比差异显著（P<0.01）。各给药组Bax/Bcl-2 蛋白比值呈现上升趋势，与模型组比较，差异具有统计学意义（P<0.01）。见表2和图4。

4 讨论

肝癌在全球恶性肿瘤中发病率居第5位，病死率居第3位[7]，因其发病快、发现难及预后差等特点，严重威胁人类健康。随着医学科学的不断进步发展，虽然一部分早期肝癌病人能得到妥善和规范的手术治疗。但是，由于大部分患者确诊时已到中晚期，且大多伴有肝硬化等严重并发症，能够进行早期手术切除治疗者毕竟是小部分[8]。近年来传统中医药治疗肿瘤方面显示出的独特优势而日益被重视，不仅可以改善肿瘤患者的症状、提高患者生活质量，而且在延长生存期方面有一定效果。研究初步提示许多单味中药都能一定程度抑制原发性肝癌的发生发展[9]。臭牡丹是著名中医药学家欧阳錡研究员发掘，湖湘欧阳氏杂病流派传承人治疗恶性肿瘤的习用中药，具有“活血散瘀、祛风解毒、消肿止痛”之功，是符合肝癌中医用药原则的中草药。

近年来多项研究表明，肿瘤的发生、发展与细胞凋亡过程关系颇为密切，凋亡过程的异常可能导致或促进肿瘤的发生[10-11]。Bcl-2和Bax蛋白是细胞凋亡过程中的关键因子，在肝癌等多种肿瘤中表达异常，已成为当今多种抗癌药物的作用靶点之一[12]。在有“死亡开关”之称的Bax/Bcl-2比值中，Bcl-2基因可抑制细胞凋亡，而 Bax基因作为Bcl-2的同源基因，能促进细胞凋亡，该比值在细胞接受刺激信号后是否存活起关键作用。换而言之，Bcl-2/Bax比值越低，细胞亡率高，反之，细胞生存率高。因此，无论是上调Bax，或下调Bcl-2都可以促进包括肝癌在内的多种肿瘤细的胞凋亡[13]。如郭芳等[14]实验证明莪术醇能体内外诱导乳腺癌MCF-7细胞的凋亡，其机制与调控Bcl-2蛋白表达和Bax蛋白表达，下调Bcl-2/Bax比例有关;另有研究发现，乳腺癌、淋巴瘤及肝癌等多种恶性肿瘤的发生发展都与Bcl-2的异常表达关系密切[15-16];国外也有研究发现，敲除Bax等促凋亡基因后正常细胞发生癌变的几率大大增加[17-18]。

根据前期研究基础和现状分析，在本实验中，我们从细胞凋亡角度探讨臭牡丹含药血清对MHCC97-H肝癌细胞周期、凋亡的影响。首先通过镜下观察MHCC97-H细胞形态的变化，然后检测细胞的周期和凋亡情况。结果显示，与模型组相比，臭牡丹含药血清组干预后，细胞出现稀疏杂乱、折光性增强等改变，且细胞凋亡率和G2/M期细胞比例亦相应增加，S期细胞比例降低，提示臭牡丹含药血清可以有效抑制MHCC97-H肝癌细胞增殖，促进其凋亡并阻止其细胞周期。为进一步探讨其抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡的分子机制，我们通过对肿瘤细胞Bax和Bcl-2蛋白表达强度的檢测，发现Bax/Bcl-2蛋白比值呈现上升趋势（P<0.01），以高剂量组最为明显。初步提示臭牡丹提取物可能通过提高Bax/Bcl-2蛋白表达水平而促进肝癌细胞凋亡。课题组将更为深入和清晰的探讨臭牡丹抗肝癌的具体机制，为其治疗肝癌提供更充足的科学依据。

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